RNAi a QPCR RNA干扰.ppt

RNAi实验原理与方法 ;RNAi 发现历程： 1990年，曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！;1998年，Andrew Fire等首次将正义链反义链RNA混合注入线虫C.elegans中，观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNA interference的概念。;2006年的诺贝尔生理学奖获得者：;RNAi的分子机制 ;RNAi效应阶段：siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。 ;RNAi pathway;miRNA and siRNA;1. 二者的长度都约在22 nt左右； 2. 二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点； 3. 二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在； 4. 二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰， 如二者在介导沉默机制上有重叠； 5. miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。 ;1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。 2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。 3.Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。 4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3’-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。 5.在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。 6.miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。 ;MicroRNA gene;(一)siRNA的设计 ;2、RNAi目标序列的选取 ;一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。 ;?/techlib/misc/siRNA_finder.html ??????/Stu/shilin/rnai.html?? ;目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片段dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备siRNA； 以及通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。 ;1.化学合成 许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究。 不适用于：筛选siRNA等长时间的研究。;2.体外转录 以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。 最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 ?不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。 ;?其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000