Western blotting ECL化学发光法使用说明.pdfVIP

Western blotting ECL 化学发光法使用说明 货号 ： SW2010 Western blotting (小鼠 IgG) ECL 化学发光法显色试剂盒 SW2020 Western blotting (兔 IgG) ECL 化学发光法显色试剂盒 SW2030 Western blotting (山羊 IgG) ECL 化学发光法显色试剂盒 SW2040 Western blotting(小鼠/兔 IgG) ECL 化学发光法显色试剂盒 SW2050 Western blotting(人 IgG) ECL 化学发光法显色试剂盒 产品内容： 1. 封闭试剂：30g(可配制 400ml)。 2. 10 倍浓缩抗体稀释液，50ml。 3. HRP 标记二抗，0.3ml，效价 1：500-1000。 4. ECL 显色液，25mlA+25mlB。 保存 ： -20℃避光密闭保存，一年有效。若经常使用，可将封闭试剂，抗体稀释液和 ECL 显色 液存放于 2-8℃以方便使用。 产品简介 ： SDS电泳后，蛋白质按照分子量大小分离，转移到固相载体 （例如硝酸纤维素薄 膜）后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与 对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，加入发光底物后，能让胶片感光。 经显影和定影后，可以在胶片上显示出条带 （抗原所在位置） 。 操作步骤 ：(仅供参考) 常规电泳转膜后: 1) 清洗转印膜：将膜剥离下后，作好标记，一般在左上角剪一缺口。室温用 TBS-T 漂 洗 3 次每次 5min,以尽量洗去转印膜上的 SDS，防止影响后面的抗体结合。 2) 按 5g 封闭试剂加 100ml 双蒸水计，配制膜封闭液，配好的膜封闭液为乳白色悬液， 将漂洗过的转印膜放入封闭液内，置摇床孵育，室温封闭 30min。用 TBS-T 缓冲液（PH7.6） 洗膜，室温漂洗 3 次每次 5min。 3) 将 10×抗体稀释液用双蒸水稀释成 1× （10ml10×抗体稀释液加入 90ml 双蒸水， 混匀， 可 4℃保存三个月） 。 此稀释液可作为一抗和二抗的稀释液。 4) 用 1×的抗体稀释液稀释一抗。根据用量以及一抗的推荐稀释浓度来稀释一抗。将 杂交膜放入杂交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育过夜或 37℃摇动孵育 2h。此用过 的抗体一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步将膜沿电泳方向剪 成条，分别作好标记，分开孵育。 5) 用 TBS-T 缓冲液 （PH7.6）洗膜，室温漂洗 3 次每次 5min。 6) 用 1×的抗体稀释液稀释二抗。根据用量，按 10ml 抗体稀释液加入 15ul HRP 标 记二抗的比例，配制二抗工作液。将杂交膜放入杂交袋中，加入二抗工作液，封口， 37℃ 摇动孵育 1h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。 7) 用 TBS-T 缓冲液 （PH7.6）洗膜，室温漂洗 3 次每次 10min。 8) 根据用量，取 ECL 发光液 A、B 等量混匀，加在膜正面，暗室显色 1-5 分种。倾 去显色液，小心用纸吸去显色液，在上面盖一层平整的透明纸。再取出感光胶片，做好标记， 轻轻的放在膜上，显色 30 秒到 1 分钟，取出胶片浸入显影液中，观察显色情况，再放入 定影液中 1 分钟。根据条带强弱，再次感光时可减短或者加长感光时间（从 5 秒到 30 分 钟）以期达到理想结果。 注意事项 ： 1. 请根据一抗来源选择试剂盒。 2. 可以根据显色结果来优化实验反应时间。如背景过深，可延长膜封闭时间，加长最 终漂洗次数与时间。如果条带过弱，可增加抗体浓度，可延长抗体孵育时间或加长感光时间。 3. TBS-T （0.01M，PH7.6）配制方法：称取 NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用 800ml 的 双蒸水溶解，用盐