自由基与检测方法.docVIP

ESR 电子顺磁共振（EPR）或称电子自旋共振（ESR）现象最早发现于1944年。它利用具有未成对电子的物质在磁场作用下吸收电磁波的能量使电子发生能级间的跃迁的特征，对顺磁性物质进行检测与分析。 自旋捕集方法是将不饱和的抗磁性化合物（自旋捕集剂）加入反应体系,与反应体系中产生的各种活性高、寿命短的自由基结合形成相对稳定的自旋加合物,以适于ESR检测 其原理是利用适当的自旋捕捉剂与活泼的短寿命自由基结合,生成相对稳定的自旋加合物,可以用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量,利用自旋加合物的数量来计算原来自由基的多少。 H： ? V：ESR测自由基是怎么被检测的（细胞，组织，溶液？体内，体外？） (MGD)2 - Fe2 +,是含有 10mmol·L- 1MGD 和2mmol·L- 1FeSO4的溶液。 体外捕集：处死后取组织（血液、细胞），加入捕集剂，ESR测定 体内捕集：腹腔注射捕集剂，处死取组织（血液、细胞），ESR测定 腹腔注射几乎没有检测到自由基信号，或者信号很弱，而处死后样品加捕获剂则可以检测到自由基信号。 通用捕获剂 典型的自旋捕捉剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，把足够量的自旋捕捉剂加入到产生自由基的体系中，自旋捕获剂就会快速地和任何出现的自由基反应，最后给出稳定的可检测的氮样氧自由基加合物。所形成的自由基加合物的ESR 谱上有被捕自由基基因给出的超精细分裂,可鉴别被捕自由基通用自旋捕获剂所形成的自由基加合物对自由基结构变化相当敏感， ESR 技术检测O-2 O-2可以与 1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)(钛铁试剂)快速反应生成一种称之为“Tiron 半醌自由基”的自旋加合物，比较稳定，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(EPR)进行检测，从而解决了生理条件下水溶液中寿命极其短暂的O-2·的定性和定量问题 ESR 技术检测·OH DMPO作自由基捕获剂对自由基结构变化相当敏感,可以提供自由基结构的详细信息。它与·OH产生的自旋加合物的ESR谱表现出特别容易识别的特征谱线。在溶液中容易形成的自我捕集产物二聚体自由基不会干扰实验结果。 ESR 技术检测血红蛋白结合的一氧化氮 在组织或血液中，一氧化氮大多与氧或过渡金属反应生成了硝酸盐或亚硝酸盐以及一氧化氮与金属的配合物。一氧化氮与血红蛋白的结合速率常数非常高，而且能够得到有特征的ESR 波谱。利用这一性质，我们可以用血红蛋白作为一氧化氮的捕集剂检测一氧化氮自由基。但是，HbNO 极易氧化，这就限制了这种方法在富氧条件下的应用。 ESR 技术检测生物体系产生的一氧化氮 一氧化氮与含金属蛋白反应产生的亚硝酰的金属配合物，往往会抑制细胞中许多重要的酶，对细胞产生毒害作用。目前应用较多的捕集剂的有 Fe2+- (DETC)2，它可与一氧化氮形成稳定的单亚硝酰-铁配合物MNIC，给出特征的 ESR 波谱。但由于 Fe2+-( DETC)2不溶于水，在一定程度上限制了它的使用。铁配合物捕集一氧化氮的最新进展得益于 Komarov等人的研究，他们使用 DETC 的衍生物 MGD，与亚铁离子合成稳定的亲水性配合( MGD)2- Fe2+，该配合物易溶于水( MGD)2-Fe2+非常适合捕集检测活细胞或组织中放的一氧化氮。但 MNIC-DETC为疏水性物质，MNIC-MGD 为亲水性物质; MNIC-DETC 可附着于细胞膜甚至进入细胞，而 MNIC-MGD 不能进入细胞。因此，根据其各自的特性，实验中应选取不同的捕捉剂。 分光光度法 概念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。 特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分的特点。 原理：利用自由基使显色剂发生颜色变化 , 根据吸光度的变化值而间接测得自由基的含量 1、羟基自由基 1．1 　 水杨酸法 Fenton 反应产生·OH, ·OH 氧化水杨酸得到 2 , 3-二羟基苯甲酸 , 用其在 510 nm 处的吸光度值表示·OH的多少 , 吸光度值与·OH的量成正比。 1．2 　 　 细胞色素 C 氧化法 其反应机理为·OH能使还原型细胞色素 C(浅红色)氧化成氧化型细胞色素 C(浅黄色) 通过测定反应体系中吸光度的减少量(550 nm) , 间接测得·OH的含量。 1．3 　 脱氧核糖法 采用 Fe3 +-EDTA-抗坏血酸-过氧化氢体系产生·OH。此方法中脱氧核糖作为·OH的攻击目标。脱氧核糖受·OH攻击后裂解 , 在酸性、 加热的条件下可与硫代巴比妥酸反应生成红色化合物。 可根据在 532 nm 处测定的吸光度值来间接反映·OH的含量。 1．4 DMSO 羟自由基氧化DMSO生成的甲醛与2,4-二硝基苯肼（DNPH）反应在碱性条件下生