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高效液相色谱条件优化实验
一、实验目的
了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理。
学习高效液相色谱仪的使用。
体会流动相种类及配比对分离结果的影响。
掌握高效液相色谱柱性能评价指标的测定及计算方法。
二、基本原理
高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法。本实验的主要目标是通过对流动相条件进行优化，使被测混合样品中各组分之间的分离度大于1.5，峰形基本对称。
高效液相色谱柱的柱效通常用有效塔板数来衡量，其计算公式如下：
式中：tR为组分的保留时间，Y1/2为色谱峰的半峰宽度，Y为色谱峰的峰底宽度。
选择性因子是评价色谱柱对两组分分离选择性的指标。与气相色谱不同的是：在高效液相色谱中，由于死时间的精确测定较为困难，因此本实验中采用保留时间之比作为评价分离选择性的指标。
分离度是评价色谱柱分离总效能的指标，两个色谱峰的半峰宽分离度可以通过下式计算：
，R=0.59R?
三. 已具备的色谱仪器条件
1．Agilent HP1200高效液相色谱仪，可变波长紫外检测器
2．色谱柱：C18键合固定相（15cm′4.6mm，5um）
3．保护柱：C18键合固定相（0.75cm′4.6mm，5um）
四、样品信息
1．苯酚、邻苯二甲酸氢钾、对甲苯磺酸钠混合水溶液
2．苯酚、邻苯二甲酸氢钾、对甲苯磺酸钠标准溶液
五、实验内容
1．混合样品的流动相条件优化
2．各色谱峰的定性鉴定
六、数据记录及处理
记录实验条件优化过程，包括实验条件、分离情况定性描述。
记录最优条件下各色谱峰的保留时间tR和半峰宽Y1/2。
3．色谱柱理论塔板数、选择性因子、分离度的测定与计算。
4．根据实验结果分析讨论色谱条件对分离的影响。
七、思考题
1．在反相键合相色谱中，常用的流动相的洗脱强度？
2．对于弱酸样品，如何获得较好的峰形和保留？
3．对于强酸样品，如何获得较好的峰形和保留？
八、实验前的预习要求
实验开始前需要提交实验方案：包括
1．初始色谱条件（写出设计依据）
2．定性方法（写出理由）
3．定量方法（如果需要做定量，你会选择何种方法，为什么？）
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