链球菌属的鉴定.docxVIP

链球菌属的鉴定1、标本要求：1.1．尽量用药前采集标本。1.2．痰液：病人清晨咳痰于无菌、防漏小塑料盒内，切勿唾液送检。1.3．尿液：病人留取12h尿液，送检。1.4．粪便：病人留取粪便510g，送检。1.5．脑脊液及其它无菌体液：用无菌瓶直接送检。血标本不要冷冻。1.6．不可接受的标本：干的拭子、蜡盒、未消毒容器、留取24h后的尿或痰、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。2、仪器35℃孵箱、普通光学显微镜3、试剂含5μg/片Optochin纸片、含0.04U／片的杆菌肽纸片、羊血平皿、麦康凯平皿、胆汁-七叶苷培养基、七叶苷培养基、湖南长沙天地人链球菌鉴定板。4、试验方法及原理：4.1 溶血性检查溶血性是鉴定球菌最常用的项目，也是鉴定过程中重要的一步。1919年Brown对溶血性进行了描述。α溶血：在血平板上，菌落周围部分红细胞被破坏，呈现一个草绿色环。β溶血：在血平板上，菌落周围红细胞完全溶解，呈现一个清楚透明溶血环。γ溶血：血平板上，菌落周围无红细胞溶解，因而无溶血环。溶血性的识别可在血平板表面菌落周围和穿刺处通过肉眼观察，也可用显微镜观察。除在分离血平板上观察菌落周围的溶血性外，还可用以下方法确认。方法：将标本接种于羊血平板上，用接种针在已接种过的血平板上扎2～3处，使细菌被接种到琼脂层深处，35℃孵育过夜。观察结果：在接种针穿刺过处，羊红细胞完全溶解，形成无色透明区，为β溶血。羊红细胞部分溶解或不溶解呈草绿色的环，为α溶血。不溶解无溶血环为γ溶血。4.2Optochin敏感试验方法：挑取被检菌落，涂在血平板上，贴 Optochin纸片于接种处，35℃，烛缸孵育18h。观察结果：抑菌环直径≥18mm为敏感，推断肺炎链球菌。抑菌环直径≤18mm时参照胆汁溶菌，或为其他草绿色链球菌。4.3 杆菌肽敏感试验方法：挑取被检菌落，密涂于血平板上，接种量应大，以免出假阳性。贴上杆菌肽纸片，35℃过夜。观察结果：形成抑菌环≥10mm为敏感，则被检菌推断为A群链球菌。4.4 CAMP试验方法：在血平板上，用金黄色葡萄球菌（ATCC25923）划种一条直线，再将被检菌距金黄色葡萄球菌 3mm处垂直接种一短线。用同样方法接种阴性和阳性对照菌。35℃孵育过夜。观察结果：在被检菌接种线与金葡菌接种线之间有一个矢形(半月形)加强溶血区，此即CAMP试验阳性。阴性无加强溶血区。4.5 胆汁-七叶苷试验(平皿法或斜面法)方法：接种被检菌1—3个菌落于胆汁-七叶苷培养基，涂划开，置35℃下，孵育24～48h。观察结果：培养基变黑色或棕褐色为阳性，不变色为阴性。注意事项：接种细菌量不能过大。本试验是测定细菌在胆盐中生长情况及同时分解七叶苷的能力，如接种菌量过大，细菌不需要生长而本身固有的酶足以造成七叶苷分解，出现假阳性结果。4.6七叶苷试验方法：接种被检菌于七叶苷培养基中，35℃过夜。观察结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。4.7 6.5％NaCl生长试验方法：接种被检菌于6.5％NaCl生长试验培养基，35℃孵育过夜。观察结果：培养基上生长出菌落并变黄色为阳性，不变色为阴性。注意点：本试验是测定细菌在高盐中的生长能力，葡萄糖作为是否生长的指示剂。细菌接种量不能过大，否则细菌并不需要繁殖即可使葡萄糖产酸，培养基变色，导致假阳性结果。5、常规鉴定过程：5.1 形态与染色：菌体呈圆形，直径0.8－1.0μm，呈链状排列，在液体培养基中易成长链。在脓汁标本中为短练，成双或单个散在。革兰染色阳性。无鞭毛、无芽胞、某些菌株在血清肉汤中可有荚膜。肺炎链球菌呈矛头状坦面相对，成双排列。5.2 培养特性:本属细菌大多为需氧或兼性厌氧菌,少数微需氧及专性厌氧。营养要求较高，在含有腹水的培养基上生长良好。最适温度为35－37℃，最适pH值7.4－7.6，在5％CO2环境下生长更好。在液体培养基如血清肉汤中，溶血性菌株呈絮状或颗粒状沉淀生长。上层液体澄清，可有菌膜。不溶血菌株则均匀浑浊生长。在血琼脂平板上，经37℃18－24h培养后可形成灰白色、透明或半透明、表面光滑、圆形、凸起、直径为0.1－0.75mm细小菌落，菌落周围出现α、β、γ三种特征性溶血环。5.3 生化反应：5.3.1 属间鉴别临床标本检到革兰阳性球菌、触酶阴性，除链球菌属外，尚有6个菌属，是：肠球菌属 Enterococcus乳球菌属 Lactococcus无色藻菌属 Leuconostoc平面球菌属 Pediococcus孪生球菌属 Gemella气球菌属 Aerococcus在鉴别上述菌属时，关键是：①革兰染色。上述菌属的革兰染色特性相似，若从琼脂平板上涂片染色，无色藻菌属中某些菌种的形态呈现球杆形、杆形，容易与乳杆菌属菌种相混淆，后者触酶亦阴性。若生长在盐肉汤涂片，最容易出现不