原代细胞培养操作(鼠胎组织细胞培养为_附件.pptVIP

* 原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例） 取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污 切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清 消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入5～10ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养 细胞培养中应注意的几个问题 1）培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度。 2）PH：初培养pH应为7.4，培养过程应不低于7.0。 3）培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10。 4）容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面积的比例为0.2-0.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的。在深的培养液（5mm）中生长较好。 5）去除死细胞 6）温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5℃，细胞生长缓慢；温度高于37.5℃，细胞存活力降低。 细胞培养中应注意的几个问题 细胞传代方法 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹 打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。 传代细胞培养操作 将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液(以液面盖住细胞为宜)，静置5～10分钟 在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液 将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养 细胞计数：　　1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。　　2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。　　3、静置3分钟。　　4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：　　细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000　　注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 2．台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色； 用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力； 方法： 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中； 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟； 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片； 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力； 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。 活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。 MTT比色法操作步骤： 　　　（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％ CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）； 　　　（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时； 　　　（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解； 　　　（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制细胞生长曲线。 慢冻程序 标准程序： 当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min 当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分