第八章 分光光度法测定叶绿素含量.docVIP

实验目的1.了解植物组织中叶绿素的分布及性质。2.掌握测定叶绿素含量的原理和方法。二、实验原理叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；在酸性条件下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有：1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯—比尔定律计算出提取液中各色素的含量。叶绿素a 和叶绿素b 在645nm 和663nm 处有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm 处。因此测定提取液在645nm、663nm、652nm 波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。三、仪器、原料和试剂仪器分光光度计、电子顶载天平(感量0．01g)、研钵、棕色容量瓶、小漏斗、定量滤纸、吸水纸、擦境纸、滴管。原料新鲜(或烘干)的植物叶片试剂1. 96％乙醇(或80％丙酮) 2. 石英砂3. 碳酸钙粉四、操作步骤取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3mL95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10mL，继续研磨至组织变白。静置3～5min。取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗，滤液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至100mL，摇匀。取叶绿体色素提取液在波长665nm、645nm 和652nm 下测定吸光度，以95％乙醇为空白对照。五、计算按照实验原理中提供的经验公式，分别计算植物材料中叶绿素a、b 和总叶绿素的含量× 叶绿素b=（12.7 A645 - 2.69A665）× 总叶绿素a=（20.0A645 + 8.02 A665 ）× 或总叶绿素a= 几种叶绿素含量测定方法比较 叶绿素含量是植物生长过程中一个重要的生理指标,由于其对周围环境很敏感,并与植物的光合作用、营养吸收等密切相关,被广泛作为植物生长的常规测定指标项目。叶绿素含量的测定方法有多种,在国际上以传统的Arnon法(也称研磨法)应用最为广泛。但该法需要把植物材料研磨并经转移、过滤或离心处理,不仅工作量大,而且不可避免地使试验人员较长时间与挥发于空气中的试剂相接触,对人体损害较大。近年来,直接浸取法受到重视,张宪政等用不同配比的混合液对叶绿素进行提取,证明了用混合液提取的可行性。李得孝,吴志旭等对传统的Arnon法进行了改进,将样品冷冻处理后,用50℃丙酮静置提取并进行测定,极大提高了工作效率。 (1)研磨法。称取0. 5 g样品于研钵内,加入少量CaCO3和5 mL 80%的丙酮,将材料充分研磨细碎直至变白(约5 min),转移至10 mL具塞离心管中,定容至刻度,摇匀后置于4℃冰箱中静置12 h,离心10 min (2000 r/min),取上清液测定。(2)直接浸取法。称取0. 5 g样品放入10 mL具塞离心管中,用80%丙酮定容至刻度,于暗柜中静置72 h浸取,取上清液测定。(3)样品冷冻后用50℃提取液提取法。称取0. 5 g样品于10 mL具塞离心管中,置冰箱中冷冻2h,取出后加入10mL在水浴锅中加热至50℃的80%丙酮,充分振摇后于暗柜中静置4h,取上清液测定。（4）叶绿素计法：叶绿素计是所有方法中最快捷的，你只需手持叶绿素计，将叶片插入仪器的感应部位，然后合上测量探头即可。应用于这种测定的仪器又被叫做便携式叶绿素仪，因为该叶绿素计拥有小巧的机身，仅200g的重量，可以方便地装入口袋并带到现场进行测量。 在以上几种测定方法中，直接浸取法提取效果最好,但耗时长,传统研磨法叶绿素的损失较大,冷冻后用50℃提取液提取法操作简便且提取速度较快,在提取率和稳定性方面均显示良好的优越性。冷冻后用50℃提取液提取法的最优试验条件为将试验材料冷冻1 h后,静置提取3 h。而叶绿素仪法，则相较于其他三种化学方法，更加快速方便。而且用SPAD-502测定叶绿素含量时，不会对叶片造成损伤，这也是使用叶绿素计的另一大好处。因为你不需要摘下叶片，直接用仪器夹住叶片测定即可，这样就可以在作物的生长过程中全程对特定的叶片进行监测，从而得到更科学的分析结果。 作者:作者：潘玲玲 徐晓洁 谭