碱裂解抽提质粒的原理.doc

碱裂解法抽提质粒的原理 SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理：细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。 1．试剂 （1）溶液Ⅰ：Tris-HCL（pH8.0）25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L,溶菌酶（临用时加）5mg/ml （2）溶液Ⅱ（新鲜配制）：NaOH 0.2mol/L,SDS 1﹪(W/V) （3）溶液Ⅲ（100ml）：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml （4）酚-氯仿-异戊醇（25：24：1） （5）无水乙醇和70﹪乙醇 （6）无DNA酶的胰RNA酶 （7）TE 2．实验流程 （1）挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃剧烈震摇下培养过夜。 （2）将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4℃以5000g离心5分钟（两次），将剩余的培养物贮存于4℃。 （3）吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 （4）将细菌沉淀重悬于100μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡。 注：溶菌酶促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。溶菌酶对反应液的pH有很大的依赖关系，当其低于8.0时，细胞裂解的效果就大为逊色。因此，溶液Ⅰ不仅使用了Tris-HCL缓冲体系，同时好加入了适量的葡萄糖而有利于pH的调节。乙二胺四乙酸（EDTA）因其是二价金属离子（如Mg2＋等）的螯合剂，故少量地存在便可抑制核酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。 （5）加200μl溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。注意不要振荡。将离心管放置于冰上5分钟。 注：SDS的作用在于使细胞裂解，以释放出质粒及染色体的DNA。在高pH（12.0-12.5）的反应体系中，则会使线性缺口的质粒DNA以及线性的染色体DNA片段被选择性地变性，而共价闭合环状的质粒DNA则不会受影响（注意：如果pH超过了12.5时，朝螺旋闭合环状DNA亦会发生不可逆的变性效应）。但在此种条件下，蛋白质同样也会发生变性，从而减轻了核酸酶对质粒DNA的降解作用的可能性。若把反应管在65℃水浴中保温一段时间，会进一步加强染色体DNA的变性作用，得到清亮的裂解液。 （6）加150μl溶液Ⅲ，盖紧管口，将管倒置，温和振荡20秒，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上5分钟。 注：pH4.8的醋酸钾溶液降低了反应混合物中的pH，起到中和作用，从而使线形的质粒及染色体DNA复性，并聚集成不可溶的网络状聚合物。同时高浓度的醋酸钾亦会引起蛋白质-SDS复合物和高分子质量的RNA分子发生沉淀，而共价闭合环状的质粒DNA分子则仍然以天然的状态保存在溶液中。这样通过离心处理，便可把网络状的DNA聚合物同变性的蛋白质-DNA等以复合物形式沉淀出来，从而使质粒DNA得到纯化。 （7）4℃，12000g离心5分钟，将上清液转移另一离心管中。 （8）加等体积酚-氯仿-异戊醇，振荡混匀。 （9）4℃，12000g离心5分钟，将上清液转移到另一离心管中。 （10）用两倍体积的无水乙醇于室温沉淀质粒DNA，振荡混匀，于室温放置两分钟。 （11）4℃，12000g离心5分钟。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。 （12）用1ml70﹪乙醇溶液洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟，弃去上清液，在空气中使核酸沉淀干燥。 （13）用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE重新溶解核酸，振荡，贮存于-20℃。