第九章 高效液相色谱测定磷脂研究进展.pdfVIP

高效液相色谱测定磷脂研究进展 崔 莹 （华东师范大学河口海岸学国家重点实验室，上海200062） 崔莹 华东师范大学河口海岸学国家重点实验室 摘要:天然磷脂是一类含磷酸的类脂化合物，广泛存在于植物的种子，动物的脑、肝、卵和 微生物体中，在工业生产、食品科学、医药学、生命科学研究方面都有重要的应用。磷脂的 研究手段有多种，本文综述了高效液相色谱分离、检测不同来源样品中磷脂的方法。 关键词:天然磷脂;高效液相色谱法;分离;检测 1、前言 磷脂类化合物是细胞膜的主要成分之一，在水介质中形成双分子层构成生物膜的骨架， 其含量约占细胞干重的 5%。分子生物学研究发现，磷脂是重要的生物活性物质及信息分子 前体的贮备形式，其水解产物可以通过影响人体内分泌或神经来调节人体代谢，改善记忆力 等，也是许多疾病形成的化学介质[1,2,3]。磷脂还是一种理想的生物标志物，通过对磷脂 组成的研究来揭示微生物生物量、群落的组成和生理状况等信息[4,5,27-31]。磷脂分子结 构中既有疏水性的脂肪酸基，又有亲水性的磷酸基，是兼性分子，因此可作为乳化剂、稳定 剂、和湿润剂，在工业生产上有重要应用[6]。各种纯度的磷脂作为药物、保健品、食品、 添加剂已经在化工、食品、医药等领域推广使用。可见，磷脂在工业生产、食品科学、医药 学、生命科学等研究方面都有重要的应用，而对磷脂进行分离、提纯则是各种研究的前提和 关键。 天然磷脂是一类含磷酸的类脂化合物，广泛存在于植物的种子，动物的脑、肝、卵和 微生物体中。各种来源的磷脂都是由多种不同分子构型的磷脂分子组成的混合物，并具有差 异性，给检测带来一定难度。对磷脂总量测定的方法有比色法、称重法、紫外分光光度法和 红外光谱法，对磷脂进行分离、提纯的方法有薄层色谱法、液相色谱、以及核磁共振法[7]， 高效液相色谱的优势在于可以避免破坏磷脂分子，减少实验误差，得到更多、更准确的分子 结构信息，具有方便、快速、高灵敏度的特点。 2、磷脂的结构组成 磷脂按照分子结构可分为磷酸甘油酯和鞘磷脂两大类。磷酸甘油酯是脂肪酸、甘油和 磷酸结合的衍生物，结构通式如下： 式中 R1、R2 代表脂肪酸残基，其碳原子数一般在 12~18，以偶碳数居多，根据分子中 X 的 不同，磷脂又可分为多种类型，如磷脂酸 PA，磷脂酰甘油PG，二磷脂酰甘油DPG，磷脂酰 乙醇胺PE，磷脂酰胆碱PC，磷脂酰丝氨酸PS，磷脂酰肌醇PI。 鞘磷脂 SM 又名神经磷脂，是由神经酰胺与磷酸直接相连，再与胆碱或胆胺连接成酯，结构 通式如下： 3、磷脂的高效液相色谱测定 用高效液相色谱分析磷脂的困难在于磷脂分子的低挥发性、不耐高温、弱紫外吸收、 易吸水、稳定性差。而且，不同来源的磷脂组成成分不同，分子中脂肪酸链长度、不饱和度 也有差别。在生物体中，磷脂一般与其他的脂类结合在一起，需要化学手段进行分离，纯化、 浓缩，才能用色谱测试，且有的磷脂分子如磷脂酰丝氨酸同时存在带相反电荷的基团，更增 加了分离和定量的难度。卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂含量较高，相关报道较多见，而含量较 低的丝氨酸磷脂则因为检测难度相对较大而较少报道。而且，随着科学研究的深入，更多的 一些微量、痕量的生命活性磷脂被发现，这一类磷脂的检测难度更大。 针对液相色谱检测磷脂存在的一些困难，出现两种解决办法：一是将磷脂分子进行衍 生化使其更有利于检测。如通过化学反应使磷脂分子改性，或直接在磷脂分子上连接发色团 或荧光基团，用紫外或者荧光检测器进行检测，可大大降低检测限，提高分离选择性[8]。 但是衍生化反应过程复杂，前处理步骤繁琐，对定量结果的准确度影响较大，操作繁琐，不 能用于磷脂的常规检测。另一种解决办法是针对磷脂的弱紫外吸收特点，可以选择使用非选 择型的检测器，如蒸发散射光检测器和质谱检测器，也可实现很好的分离、检测效果，蒸发 光散射检测器在磷脂的测定方面具有很大的优势，而质谱检测器，不但可以降低检测限，还 可得到分子结构信息，是目前国内外研究的热点。 测定磷脂的液相色谱法根据所用的固定相不同可分为正相色谱和反相色谱。正相色谱 一般以硅胶柱或氰基柱为固定相，流动相有氯仿-甲醇-氨水、正己烷-异丙醇-水以及乙腈- 甲醇-水，而反相色谱则多以 C18、C8 为固定相，流动相为甲醇-乙腈-水或单纯的甲醇。 将文献中各测定条件及结果归纳如下。