不同胚龄昆明小鼠胚胎获取胚胎干细胞体外培养比较分析.docVIP

　　不同胚龄昆明小鼠胚胎获取胚胎干细胞体外培养比较分析 【摘要】 目的 探讨分离培养昆明小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的最佳胚龄。方法 分别从孕3.5d和4.5d的母鼠子宫中分离收集桑椹胚和囊胚，比较体外培养时胚胎的贴壁率、内细胞团(inner cell mass, ICM)形成率、形成ES细胞克隆率(P1)和形成ES细胞亚克隆率(P2)。结果 孕3.5d采集的胚胎多为桑椹胚，孕4.5d采集的胚胎多为囊胚，分离培养结果表明，后者的胚胎贴壁率、ICM形成率和ES细胞克隆形成率均高于前者，均有显著性差异(Plt;0.05)。结论 囊胚较桑葚胚更适合作为体外分离培养昆明小鼠ES细胞的材料。 【关键词】 昆明小鼠;胚胎干细胞;胚龄 　胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES细胞)是从早期胚胎内细胞团(inner cell mass, ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)分离出来的能在体外长久培养的、具有多向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。ES细胞的用途很广，涉及医学和生物工程的许多领域。 　　1981年，EVANS[1]和MARTIN[2]首次成功分离得到小鼠ES细胞。目前实验中常用的小鼠ES细胞系绝大多数来自129品系，但129品系小鼠易感染多种疾病，具高频自发畸胎瘤，因此该品系小鼠不宜用于免疫学和细胞、组织移植等研究[3]。 　　昆明小鼠是一种国产远交系小鼠，其基因型与人类近似，建立昆明小鼠的ES细胞系有利于其转基因动物的获得，能够更好服务于我国的科研工作。目前虽有关于昆明小鼠ES细胞的一些研究，但对于何时收集胚胎尚未有明确报道。本实验旨在研究胚龄对分离培养昆明小鼠ES细胞的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物 选取8周龄昆明品系雄性小鼠21只;周龄为7～8周、体重为30g的雌性小鼠20只，用于分离培养鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF);周龄为4周、体重为24～26g的雌性小鼠55只，用于分离培养ES细胞。实验动物由辽宁医学院实验动物中心提供[动物质量合格证号：SYXK(辽)2003?0011]。 　　1.2 主要试剂与仪器 L?DMEM培养基(Gibco公司，批号1459071);H?DMEM培养基(Sigma公司，批号055k8311);胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所，批号AB?3101C091);丝裂霉素?C(浙江海正，批号050912);白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor, LIF)(Sigma公司，批号064K1083);NBT?BCIP染色试剂盒(华美公司，批号NBS206006);CO2培养箱(美国SIM公司，E191TC);倒置显微镜(日本Olympus公司，CKX41)。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 MEF的分离培养及饲养层的制备 雌雄鼠合笼，每天早上观察阴道栓，见栓当天上午定为怀孕的第0.5天(days post coitum, dpc);取孕12.5～14.5d母鼠，断颈处死，无菌条件下取出胎鼠，去除头部、尾部、内脏和四肢，用无菌眼科剪将躯干部剪成1mm3以下的碎块，用滤网过滤细胞法[4]分离培养MEF，并制备MEF饲养单层。 　　1.3.2 胚胎的收集与培养 分别取孕3.5、4.5d母鼠，断颈处死，无菌条件下取出子宫;用1mL无菌注射器吸入冲胚液，从子宫角端进针，保证针头进入子宫腔内，将冲胚液快速推入子宫腔;每侧子宫注入冲胚液0.2～0.5mL，冲胚液会将胚胎冲出;将盛有胚胎和冲胚液的平皿置于40～100倍的倒置显微镜下;用移液器(上海大龙公司，0.2～10mu;L，YR23777)收集胚胎;以文献[5]所示方法进行培养。 　　1.4 主要观察指标 　　1.4.1 生物学特性观察 每日于显微镜下观察并记录胚胎的生长情况(包括形态、贴壁情况、ICM形成情况等)。 　　1.4.2 碱性磷酸酶(AKP)检测 胚胎经40g/L多聚甲醛固定0.5～2h;PBS洗涤3次;用TSM?Ⅰ(0.1mol/L Tris, 0.1mol/L NaCl, 0.01mol/L MgCl2, pH 8.0)平衡，重复3次;再用TSM?Ⅱ(0.1mol/L Tris, 0.1mol/L NaCl, 0.05mol/L MgCl2, pH 9.5)平衡，重复3次;加入NBT(350mu;g/mL)/BCIP(180mu;g/mL)，37℃避光反应30min;三蒸水洗涤3次，显微镜下观察。 　　1.5 统计学分析 用SPSS11.5软件对实验所得数据采用t检验，Plt;0.05为差异有统计学意义。 　　2 结 果论文代写 　　2.1 不同胚龄胚胎的生物学特征 本实验共