丙酮酸对过氧化氢诱发PC12细胞损伤的保护作用论文.docVIP

　　丙酮酸对过氧化氢诱发PC12细胞损伤的保护作用论文 安丽荣 郭艳芹 金连弘 傅松斌【摘要】 目的 研究丙酮酸对过氧化氢(H2O2)诱发小鼠嗜铬细胞瘤瘤细胞（PC12细胞）损伤的保护作用并初步探讨其保护机制。方法 将培养的PC12细胞分为三组：正常对照组；损伤组；保护组，在用H2O2处理前30 min加入丙酮酸。通过细胞形态学方法，化学比色法测定琥珀酸脱氢酶(MTT)含量，乳酸脱氢酶(LDH)释放量，超氧化物歧化酶(SOD)含量和丙二醛(MDA)含量，观察丙酮酸的神经保护作用。结果 通过形态学方法，保护组细胞数显著比损伤组多，受损变圆的细胞数较少。保护组可明显降低细胞LDH释放量和细胞内的MDA含量(P＜0.01)；提高MTT测定值和SOD活性。结论 丙酮酸对H2O2诱发PC12细胞损伤有显著的保护作用。 【关键词】 PC12细胞；丙酮酸；H2O2 近年实验证明丙酮酸能预防由氧化应激引起的内皮细胞的凋亡〔1〕.freeler(AD)病的治疗提供有意义的药物学依据。 1 材料与方法 1.1 实验样品 PC12细胞，购自上海细胞生物所细胞库。 1.2 试剂 MTT、NADH购自Sigma公司，DMEM培养基、胎牛血清、马血清蛋白等，购于Hyclone公司，其他试剂，均为国产分析纯。乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒，均为南京建成生物工程研究所。 1.3 仪器 高速冷冻离心机（HITACHI20PR520，日本），紫外可见分光光度计（PERKENELMERLambda17，西德），倒置显微镜（OLYMPUSDP10，日本），二氧化碳孵箱（REVCO/LINDBERGRCO3000TVBB，美国），BCM100型生物洁净工作台(苏净集团安苏空气技术有限公司)，酶标仪（BIORADModel550，日本）。 1.4 细胞培养和预处理 在37℃，5%CO2孵箱内培养PC12细胞，DMEM培养基中含10%马血清和5%胎牛血清，加入100 μg/ml链霉素和100 μg/ml氨苄青霉素。细胞为上皮样贴壁生长，每2～3 d传代1次，取生长期细胞用于实验。将细胞分为三组：正常对照组，常规加入培养液；损伤组，同时加入培养液和H2O2，H2O2终浓度为200 μmol/L；保护组，加入培养液和丙酮酸30 min后，再加入H2O2，丙酮酸终浓度分别为5、10、20 mmol/L，H2O2终浓度为200 μmol/L。 1.5 MTT方法 细胞以1×104/孔的接种量接种于96孔培养板上。同上分组，每组7孔。37℃孵育过夜后，弃去培养液。进行如上预处理。H2O2组孵育10 h后弃去药液及培养液，每孔加入MTT(5 g/L)25 μl（取MTT100 mg，用高压灭菌的PBS配制成5 g/L贮存液20 ml，0.22 μm滤膜过滤除菌，4℃避光可以保存2 l表示。 1.7 PC12细胞内SOD和MDA含量测定 吸去培养液，冰生理盐水洗涤细胞2次，用塑料细胞刮子刮下细胞，冰生理盐水收集，冰浴中用超声细胞破碎仪破碎细胞(20 kHz，2 min)，显微镜下观察无细胞后，分别取100 μl按SOD及MDA测定试剂盒说明书操作，比色法测定PC12细胞内SOD及MDA的A值并计算其活性。其活性单位以U／mg表示。 1.8 统计学分析 采用SPSS10.0软件处理，数据以x±s表示,采用方差分析检验方法对数据进行统计。 2 结 果 2.1 形态学观察 显微镜下可见正常对照组细胞形态呈梭形或多角形，细胞数量多。损伤组细胞数量显著减少，部分细胞形态正常，呈梭形或多角形，部分细胞损伤呈圆形。保护组细胞数量增多，大多数呈梭形或多角形，极少数细胞损伤，呈圆形。见图1。 图1 各组细胞显微照像比较（×200） 2.2 MTT实验 正常对照组测定MTT OD值为0.107±0.010 1，损伤组为0.028±0.002 8，与正常对照组相比显著降低(P＜0.01)，说明损伤组细胞的琥珀酸脱氢酶(MTT)活性低，活细胞数较少。丙酮酸5、10、20 μmol/L组MTT OD值分别为0.078±0.004 1，0.085±0.004 8，0.091±0.006 3；与损伤组相比显著升高(P＜0.01)。说明丙酮酸各浓度组MTT的活性高，活细胞数增多，丙酮酸具有保护作用。 2.3 LDH、SOD和MDA的检测 损伤组细胞上清液LDH活性增大(P＜0.01)，说明细胞膜损伤严重，漏出大量LDH酶；丙酮酸各浓度组细胞LDH较小(P＜0.01)，说明细胞膜损伤较轻，丙酮酸具有保护细胞膜的作用。见表1。与正常组相比，H2O2损伤组PC12细胞内SOD活性明显降低(P＜0.01)，MDA水平明