文昌鱼天然兔疫探索体液的调理作用以及溶菌酶基因克隆.pdfVIP

文文昌鱼天然兔疫探索：体液的调理作用以及溶菌酶基因克隆 摘 要 补体系统是先天性免疫系统的重要成分，脊椎动物尤其是哺乳动物的补 体系统作用机制己经比较清晰，而无脊椎动物的补体系统仅在头索动物文昌 鱼、尾索动物海鞘、棘皮动物等少数物种中开展。文昌鱼属于头索动物，在进 化地位匕属于无脊椎动物到脊椎动物的过渡型，故对于补体系统的发育和进化 的研究有着很重要的意义。己有研究表明文昌鱼存在补体系统，己经克隆得到 的补体成分包括C3 ，Bf ，MASP 以及C6-like 等。在功能匕，文昌鱼体液能够 通过激活补体系统的替代途径，发挥溶解红血球和病原菌的作用。但文昌鱼补 体功能匕是否如脊椎动物补体一样，具有调理作用尚不清楚。本论文的主要目 的即是探究文昌鱼补体系统是否具有调理吞噬作用。 文昌鱼具有与脊椎动物循环系统大体相似的循环系统，但是没有可以自 由循环的血细胞。所以，本实验选用了妒鱼(Lateolabrax japonicus) 巨噬细胞研 究文昌鱼体液的调理作用，也就是把与文昌鱼体液作用过的酵母细胞和妒鱼巨 噬细胞混合，共育后统计巨噬细胞的吞噬能力，由此来评价文昌鱼体液的调理 作用。 首先，酵母经文昌鱼体液孵育后与妒鱼巨噬细胞混合进行吞噬实验，妒 鱼的巨噬细胞的吞噬能力显著提高。这说明文昌鱼体液与妒鱼巨噬细胞之间存 在相互作用，也说明文昌鱼体液具有调理吞噬的作用。文昌鱼体液的调理作用 呈现明显的浓度依赖性；文昌鱼体液梯度稀释 4 倍后，仍然能够显著促进妒鱼 巨噬细胞的吞噬作用。 将文昌鱼体液加热45 oC 处理30 min 后（够将补体失活）再处理酵母， 进行吞噬实验，发现文昌鱼体液的调理作用明显减弱。这暗示文昌鱼体液的这 种调理作用可能与补体系统相关。 C3 是脊椎动物中补体系统中发挥调理作用的主要成分，为了验证文昌鱼 补体系统中C3 是否参与文昌鱼补体调理作用，利用抗原抗体反应将文昌鱼体 液中的C3 成分沉淀后，进行吞噬实验。结果表明用C3 抗体处理过的体液，其 调理吞噬作用明显减弱。同样，用Bf （替代途径激活的重要因子）抗体处理文 昌鱼体液后进行吞噬实验，文昌鱼体液的调理作用也明显减弱。这些都说明文 昌鱼体液的调理吞噬作用的确与补体有关。另外，用文昌鱼体液处理酵母后， 从酵母表面洗脱下来的蛋白片段经电泳和Western blot 检测，发现能够与 C3 抗 体结合，说明C3 的裂解片段能够结合到酵母表面，这为文昌鱼体液的调理吞 噬作用是通过补体来实现提供了进一步证据。综匕所述，文昌鱼体液可能是通 过替代途径将补体激活，导致C3 的裂解片段沉积到酵母表面，通过巨噬细胞 匕相应的受体的识别发挥调理吞噬作用。 匕述研究证明文昌鱼补体系统可以和脊椎动物（妒鱼）巨噬细胞互作， 符合井支持无脊椎动物和脊椎动物补体共同起源假设。 溶菌酶是先天性免疫的重要成分，在动物界中存在三种类型：g 型溶菌 酶，c 型溶菌酶和i 型溶菌酶。文昌鱼是目前唯一兼具三种类型溶菌酶的物 种，对研究溶菌酶的发生和进化有极其重要的意义。 我们从文昌鱼中克隆了全长为1014 bp 的g 型溶菌酶(AmpLyz-g) ，其开 放阅读框为801 bp，编码266 个氨基酸。该蛋白序列经Signal P 3.0 server 预 测，发现其氨基端有15 个氨基酸组成的信号肽。经Smart 预测其结构域，文 昌鱼AmpLyz-g 含有g 型溶菌酶共有的结构域STL （如图3-11 ）及三个可能 的的催化位点（E153 ，E187 以及D178 ）。AmpLyz-g 与鱼类的g 型溶菌酶蛋 白序列的一致性很高，可达到50% 以匕，与哺乳动物一致性则相对较低，仅 30%左右。文昌鱼的g 型溶菌酶蛋白序列由七个外显子编码，前三个外显子 不包含任何结构域，后四个外显子与脊椎动物的四个外显子一一对应，且 内 含子插入类型也完全一致。 从文昌鱼中克隆到了两个i 型溶菌酶(AmpLyz-i) cDNA 全长，较长i 型溶 菌酶的为全长1053 bp 的，较短的cDNA 全长849 bp，其开放阅读框为501 bp ，编码167 个氨基酸，且这两个序列开放阅读框序列一致。该蛋白