第十三篇 基因功能的验证.ppt

第十三章 基因功能的验证 一是通过增强其表达，取得表达产物进行研究， 增强其表达因为不能反映基因产物的真实表达情况，而逐渐被抛弃 二是减弱或者终止其表达，观察整体功能的变化，进而推测相应的基因功能 1 RNA干扰技术 RNAi 技术的应用  在功能基因组中的应用 在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能。 由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。 基因敲除技术 基因敲除（knock out of gene）：利用基因打靶技术，用无功能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除。 构建重组载体 重组DNA转入受体 细胞核内 筛选目的细胞 转基因动物模型的建立 酵母双杂交技术 鉴定新的蛋白与蛋白相互作用 鉴定蛋白级联底物 鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响 在已知的相互作用中鉴定干扰蛋白质 (反向双杂交系统) 拉下实验 是一种在体外研究两种或多种蛋白质之间物理相互作用的方法 蛋白组学研究 基因组是指一个细胞单倍型所含的全部遗传信息，即DNA或RNA编码的遗传信息 蛋白质组则是指一个细胞一生中表达的蛋白质总和 蛋白质组学是研究蛋白质组的一个新的领域，主要研究蛋白质的特性，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质相互作用，在蛋白质水平上了解细胞的各项功能、各种生理生化过程及疾病的病理过程等 第一相电泳根据蛋白质的不同等电点分离各种蛋白质，即等电聚焦法(isoelectrie focusing IEF) 第二向电泳根据蛋白质的不同分子量进一步分离等电点相同的蛋白质，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS) 双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主要技术之一, 双向电泳根据等电点和分子量可一次性分离数千种蛋白质，经染色后蛋白质再PAGE上可形成密度不同、分布不均的复杂点图谱。 如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的蛋白质点进行检测、定量、比较、分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的信息是双向电泳分析软件所要解决的问题。 蛋白质的分离与鉴定 蛋白质经双向电泳分离及图像分析后，将蛋白质斑点胶块切下，用蛋白酶通常用胰蛋白酶)对蛋白质样品进行胶内酶解，获得肽片段 * * 它是指外源性与内源性双链RNA触发编码区同源mRNA 特异性的降解，而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默(post-transcriptional??gene??silencing)。 当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。 DNA-Binding Domain Bait Protein Prey Protein Transcription Activating Region Reporter Gene DNA-Binding Site 反式作用因子中的两个功能结构域 DNA结合域 转录激活结构域 酵母双杂交系统应用 利用酵母作为真核蛋白相互作用的模型 人体内肝癌细胞的转移与细胞中第８号染色体短臂的缺失密切相关 蛋白质双向电泳(two-dimensional eleclrophoresis，2-DE)是一种方便、灵敏的蛋白质分离方法 差异点： * *