重组ChIFNγ基因的表达及油菜的遗传转化.pdf

目 录 目 录1 摘 要4 前 言6 1.1 干扰素的研究进展6 1.1.1 干扰素的生物活性6 1.1.2 IFN-γ的研究进展7 1.1.3 干扰素的应用研究8 1.2 目的基因转化方法9 1.2.1 农杆菌介导转化法9 1.2.2 基因枪法10 1.2.3 激光微束穿刺转化法10 1.2.4 其他转化方法11 1.3 植物生物反应器12 1.3.1 植物生物反应器的研究进展12 1.3.2 转基因植物作为生物反应器存在问题与解决方法13 1.4 目的及意义16 实验部分17 1.油菜偏嗜性ChIFN-γ合成及原核表达17 1.1 材料与方法17 1.1.1 菌种与质粒17 1.1.2 工具酶和试剂17 1.1.3 主要仪器18 1.2 基因的设计与合成18 1.2.1 基因的设计18 1.2.2 质粒pBSK-ChIFN-γ的提取18 1.2.3 PCR 扩增目的基因ChIFN-γ19 1.2.3 PCR 产物的胶回收19 1.2.4 ChIFN-γ基因的克隆20 1.2.5 表达载体的构建22 1.2.6 诱导表达23 1 1.3 结果与分析25 1.3.1 基因的设计25 1.3.2 ChIFN-γ基因的扩增25 1.3.3 ChIFN-γ基因的克隆26 1.3.4 表达载体的构建26 1.3.5 ChIFN-γ在大肠杆菌中的表达27 1.4 讨论29 2 植物表达载体pSW-Napin-ChIFN-γ-NOS 的构建及遗传转化油菜的研究30 2.1 实验材料与试剂30 2.1.1 实验材料30 2.1.2 主要试剂30 2.2 实验方法33 2.2.1 真核表达载体pSW 及质粒pBSK-NGN 的提取33 2.2.2 PCR 扩增目的基因Napin-ChIFN-γ-NOS33 2.2.3 PCR 产物和真核表达载体pSW 的酶切及胶回收33 2.2.4 胶回收片段的连接及转化大肠杆菌TG1 感受态细胞34 2.2.5 植物表达载体pSW-NGN 转化农杆菌EHA10534 2.2.6 无菌材料的准备35 2.2.7 农杆菌介导油菜遗传转化35 2.3 结果与分析37 2.3.1 表达载体pSW-Napin-ChIFN-γ-NOS 的构建37 2.3.2 pSW-Napin-ChIFN-γ-NOS 遗传转化油菜40 2.4 讨论41 3 抗性植株的分子鉴定42 3.1 实验试剂42 3.1.1 植物基因组提取试剂：42 3.1.2 PCR 检测试剂42 3.1.3 Southern blot 试剂42 3.1.4 GUS 染色试剂：43 3.1.5 转基因植株ChIFN-γ蛋白检测试剂43 3.2 实验方法43