第八章 分子标记相关实验步骤.pdfVIP

实验一 植物 DNA 的提取与分离 一、目的： 学习并掌握 CTAB 法提取植物总 DNA 的原理和操作步骤。 二、原理和方法 关于植物总 DNA 的提取方法相关文献报道很多，但从提取原理上看主要有二 种:CTAB法及 SDS 法。 1、CTAB （十六烷基三乙基溴化铵）法： CTAB 是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液 中(0.7mol／L NaCl)是可溶的。采用氯仿／异戊醇抽提蛋白质，通过离心就可将 CTAB 与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将 CTAB 与核酸的复合物 溶液加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇。 CTAB 法提取 DNA 最初用于冷冻干燥的材料。其程序及试剂比例经适当改动 后也于新鲜植物组织及细胞器DNA 的提取。用冷冻干燥材料提取时，使用 1×CTAB。 用新鲜材料提取时使用 2×CTAB 缓冲液。 实验需要注意的问题是 CTAB 溶液在 15℃以下会发生沉淀，所以含 CTAB 的 溶液不能在低温下离心。 与 SDS 法相比，CTAB 法的最大优点是能很好地去除糖类杂质，对于含糖较 高的材料可优先采用，该方法另一个特点是在提取的前期能同时得到高含量的 DNA 和 RNA。 2、SDS （十二烷基硫酸钠）法： 其原理是利用高浓度的 SDS，在较高温度( 55～65℃ )条件下裂解细胞，使 染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的作法 使蛋白质及多糖杂质沉淀 (有的是加 5mol ／L 的KAC 于冰上保温，在低温条件 下 KAC 与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中的 DNA 用 酚／氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。 SDS 法操作简单，温和，也可提取到分子量较高的 DNA，但所得产物含糖类 杂质较多。 三、材料、试剂和仪器 1 试验材料： 新鲜或超低温冷冻干燥植物组织 0.2g 2 试剂： 无水乙醇，70％乙醇，氯仿 2%CTAB 提取缓冲液： 2g/100ml CTAB 100mmol/L Tirs ·Cl(pH=8.0) 50mmol/L EDTA(pH=8.0) 700mmol/L Nacl(pH=8.0) 3 仪器设备： 恒温水浴锅，离心机，移液器及配套枪头，离心管，研钵 四、步骤 1）取约0.2g 叶在含有 750ul 左右提取缓冲液的研钵中磨碎，后转至 1.5ml 的离心管中，60℃水浴 30min～1h,其间轻轻颠倒 2-3 次； 2）取出冷至室温，然后用等体积氯仿-异戊醇（24：1）轻轻混匀并颠倒约 5～10min，然后 10000r/min 离心 10min； 3）轻轻取出，用一新的离心管移出上清液，然后用 2 倍体积的预冷 (-20℃) 无水乙醇沉淀； 4）待DNA 收缩成团后，将其用 70%乙醇洗 1～2 次后,干燥,然后用无离子水 溶解后保存在－20℃冰箱中备用。 五、结果 记录观察每个步骤中溶液的颜色、有无沉淀产生、沉淀物颜色等变化。 实验二 DNA 的定量分析 一、目的 了解检验DNA 定量分析的方法和原理，熟悉检验提取 DNA 的质量，包括浓度 与纯度的具体步骤和操作过程。 二、原理和方法 1、浓度 DNA 样品的浓度一般可根据其在 260nm 的吸收值来确定。 50ug ／ml 的双链DNA 对 260nm 紫外光的吸收值为 1.0。 凡是浓度大于 0.25 ug ／ml 的纯净DNA 样品均可按此关系，由其 OD 值求出其浓度。 260 测定时因比色杯最小的容积为 0.5ml，微量制备的样品总体积不过 20～ 100ul，因此应从所制备的样品中取出少量稀释后进行测定，根据稀释样品的吸 收值及释释倍数计算出原样品的 DNA 浓度。 测定方法：取 20ulDNA 样品溶液，加 dH O 至 3ml，混匀后注入 5ml 的石英比 2 色杯中，以 dH O 为空白对照调零后进行测定。 2 DNA 样品浓度