硫氧化细菌的筛选及特性研究实验方案.docxVIP

材料和方法(Materials and methods)1 培养基与仪器仪器:仪器名称型号高效液相色谱仪超净工作台生化培养箱高压灭菌锅电子天平恒温摇床实验室超纯水系统紫外可见分光光度计pH计培养皿试管（带塞）锥形瓶烧杯表1 LB培养基药品用量/（g/L)酵母膏蛋白胨氯化钠5.010.010.0表2 DM培养基主要药品和用量药品 用量/(g/L)Na2S2O3·5H2O10. 00MgCl20. 50K2HPO43. 00CaCl20. 20NH4Cl 4.00蒸馏水 100mL表3 微量元素溶液药品用量/μg乙二酸四乙酸二钠（EDTA)ZnSO4·7H2OCaCl2MnSO2— 4·4H2OFeSO4·7H2ONH4)6Mo7O24·4H2OCuSO4·5H2OCoCl2·6H2O50225.541051.101.571.61调节pH至6.0，微量元素溶液取10mL固体培养基:在液体分离培养基Ⅰ的基础上加入质量分数 2%的琼脂粉.由于硫化物在偏酸性条件下变成硫化氢气体溢出，不方便检测，因此培养基中以 硫代硫酸钠代替硫化物作为电子供体用以硫氧化细菌的生长代谢。硫代硫酸钠过滤除菌，按 50 g/L 加入到高温灭菌的不含 硫代硫酸钠的培养基中。培养基初始 pH 用 HCl 调整至 6.8 左右，加入 2 %的琼脂可制备固体琼脂平板。菌株的筛选菌株的富集与分离筛选水样以10%接种量接到无机盐培养基中，30 ℃、160 r/min的摇床下振荡培养，待细菌生长活跃，以呈浓度梯度的硫化钠溶液进行驯化，选择经数次驯化，pH和硫酸根变化效果明显的培养液，稀释涂布到固体平板上，待长出菌落，挑取单菌落进行画平板划线分离，挑取生长较好的菌落，进一步分离纯化7~8 次，得到纯化降解菌株. 将纯化好的降解菌株回接于以硫代硫酸根为底物的无机盐基础培养液中，验证其是否有降解能力，若出现混浊，则将其分离，接种于LB斜面培养基上, 培养24 h 后，置于4 ℃冰箱保存备用.1.3 菌株的Biolog系统鉴定菌株的Biolog实验参考文献[11]方法进行，采用GN2碳源板鉴定.富集培养与分离纯化富集：将 1mL 振荡均匀的污泥接种到 100mL 灭菌的DM培养液的锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱中，在 30℃、200r/min的条件下进行振荡培养2d。作为第一代。2d后，取出锥形瓶静置，取第一代上层液体5mL，接种至装有95mL灭菌的DM培养液锥形瓶中，在BSD-250恒温振荡培养箱摇床上以30℃、200r/min的条件下进行振荡培养2d。作为第二代。同理培养至第五代。划线：（一）、右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，挑取第五代富集培养样品少许。（二）、左手斜持琼脂平板，皿盖留在桌上，于火焰近處將菌塗于瓊脂平板上端，來回劃線，涂成薄膜（约占平板总表面积的十分之一），划线时接种环与平板表面成30~40o角，轻轻接触，以腕力在平板表面行轻快地滑移动作，接种环不应划破培养基表面。（三）、烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷（是否冷却，可先在培养基边缘处试触，若琼脂溶化，表示未凉，稍等再试），从薄膜处取菌作连续平行划线，约占平板表面五分之一左右，再次烧灼接种环，等三次平行划线……以同样方法作第四次，第五次划线，将平板表面划完。（四）、划线完毕，盖上平皿盖，底面向上，用标签或腊笔注明菌名检验号码，接种者信息等，置30℃恒温振荡培养箱培养2d。作为第一代。筛选：培养2d后，观察到固体培养基中有白色针尖状小菌落长出，菌落周围培养基变黄.。即确定为初筛的硫氧化细菌。挑取单菌落接种于1mL 经消毒处理后的蒸馏水中稀释，采用平板划线法再次接种至培养基上，在BSD-250恒温振荡培养箱摇床上以30℃、200r/min的条件下进行振荡培养2d，作为第二代。同理培养至第五代。硫氧化细菌接种液的培养挑取经过筛选的第五代硫氧化细菌的单菌落接种到装有100mL经过消毒处理的DM液体培养基的锥形瓶中，在BSD-250恒温振荡培养箱摇床上以30℃、150r/min的条件下进行振荡培养2d. pH、温度、溶氧对生长的影响pH 值、温度、溶氧对菌株 JFA2 生长的影响的研究在无机培养基中进行。在 30.00 g/L Na2S2O3浓度，初始 pH 分别为 3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00 和9.00 液体培养基中接种 5 %的硫氧化细菌液，200 rpm，30℃下培养，测定其 OD600值，以