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Standard Operation Protocol（SOP） 技术方法名称: Hoechst33258荧光染色观察药物诱导细胞凋亡 基本原理: ?? Hoechst?33258，也称bisBenzimide?H33258或HOE33258。分子式为C25H24N6O·3HCl，分子量为533.88，CAS Number 23491-45-4。?Hoechst 33258溶于水，溶解度可达10mg/ml。????Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33258工作浓度为0.5-10μg/ml。????Hoechst?33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。????Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。试剂与器材 1. Hoechst 33258 贮存液： 称取 Hoechst 33258 试剂 1mg ，用 20ml 蒸馏水溶解后，滤过， 4℃ 避光保存。用时蒸馏水 10 倍稀释成染色液。 2. 封片液（ pH5.5 ）： 20mmol/L 柠檬酸； 50mmol/L 磷酸氢二钠； 50% 甘油， 3. 细胞固定液 ，现配。 操作步骤 1. 将细胞以×105 /ml或其他适宜的密度接种于用培养中，培养每孔ml， 37℃ 、 5%CO 2 孵箱中培养至细胞贴壁，加入， 继续培养过夜。2. 4%多聚甲醛固定细胞4℃固定 min 3. 去固定液，用PBS 洗2遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。 PBS清洗后，加 Hoechst 33258 染色液， 10min 4. 用PBS洗两遍，每次3分钟，5. 封片剂封片后荧光显微镜下观察并拍照。荧光显微镜 ?附注：细胞爬片方法 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板或35mm培养皿内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。 悬浮细胞 染色步骤1. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，4℃固定10-20min。 2. 离心去固定液，用PBS洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动。 3. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。 4. 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。 5. 均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。 6. 用PBS洗两遍，每次3分钟。 7. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。 8. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右 Hoechst 33258，也称bisBenzimide H 33258或HOE 33258。分子式为C25H24N6O·3HCl，分子量为533.88，CAS Number 23491-45-4。 Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。 Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。 Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。 Hoechst 33258溶于水，溶解度可达10mg/ml。 用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33258工作浓度为0.5-10μg/ml。包装清单： 产品编号 产品名称 包装 C1011 Hoechst 33258 10mg — 说明书 1份 保存条件： -20℃避光保存，一年有效。注意事项： Hoechst 33258对人体有害，请注意适当防护。 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。 为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液。抗荧光淬灭封片液(P0126)可以向碧云天订购。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 荧光染料Hoechst 33258是一种可对DNA染色的细胞核染