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鱼腥草对柯萨奇病毒的抗病毒作用 目的:　　　　 探讨中药抗柯萨奇病毒（coxsackievirus B3,CVB3）的作用。方法:采用微量细胞培养法观察细胞病变效应(Cytopathiceffect,CPE) 进行抗体外实验。BALB/c 小鼠接种建立病毒性炎动物模型，随机分为正常对照组、病毒对照组和药物对照组，观察各组病理变化，Real-time 定量PCR 检测小鼠心肌 RNA 水平。结果: 体外对细胞生长无影响的最大无毒浓度为 生药/ml。中药颗粒在预防给药、同时给药和治疗给药三种培养方式下，保护感染细胞所需有效药物浓度均低于病毒唑。与同期病毒对照组小鼠比较，中药治疗组小鼠心肌炎症病理变化明显减轻， RNA 拷贝数降低（P0.05）。结论: 可抑制病毒，对病毒感染的细胞和小鼠心肌具有保护作用。　　　　关键词： 柯萨奇病毒 细胞培养 　　　　　　　　0.引言　　　　是临床常见病，近年来发病率呈上升趋势，成为青少年的重要原因，危害人类特别是青少年健康。其详细发病机制虽未完全阐明，但已明确病毒感染后直接侵犯心肌细胞死亡或代谢功能丧失参与其发病。几乎所有的病毒均有可能引起心肌炎，其中以柯萨奇病毒最易引起。目前临床仍缺乏有效的抗病毒药物，因此开发抗病毒新药是一个研究热点。我们根据传统中医辨证施治理论，结合现代医学研究方法首次精选研究其体外抗 作用及对实验性小鼠病毒性的治疗效果，为临床应用提供实验依据。　　　　1.材料和方法　　　　1.1 材料　　　　1.1.1 病毒和细胞株　　　　（Nancy 株）Hela 细胞　　 1.1.2 实验动物　　　　190 只6-8 周龄健康雄性BALB/c 小鼠，体重20±2 克，SPF 级实验动物，　　　　1.1.3 药物、试剂与主要仪器　　　　；病毒唑VitC ；RPMI1640 培养液、新生牛血清；Trizol；CVB3 引物和荧光定量PCR 检测内参照及标准品试剂盒；逆转录试剂盒；SYBR Green I PCR Master Mix 和ABI PRISM 7000　　1.2 方法　　　　1.2.1 药物抑制病毒体外实验　　　　1.2.1.1 细胞毒性实验　　　　将药物倍比稀释1：1，1：2……1：528。Hela 细胞接种于24 孔培养板中，各设4 个重复孔，置37℃，5%CO2 孵箱培养1 小时。补加含2%小牛血清的RPMI1640 培养液至每孔1ml，继续孵箱培养，逐日观察记录细胞病变作用（cytopathiceffect,CPE）。　　　　1.2.1.2 药物抗病毒效应检测　　　　用于体外抗病毒实验的TCID50 为100/0.1ml。Hela 细胞培养同上。拟定中药对CVB3作用方式分3 个组：（1）预防给药组（药物对病毒感染细胞的阻断作用）：药物0.1ml 加人细胞板预先与细胞孵育1 小时，再加入病毒液0.1ml 感染细胞；（2）同时给药组（药物对病毒的直接杀伤作用）：药物和病毒液各0.1ml，37℃孵育1 小时后感染细胞；（3）治疗给药组（药物对病毒在细胞内增殖的抑制作用）：0.1ml 病毒液感染细胞孵育1 小时后加入0.1ml药物。逐日记录观察细胞病变效应。各组均设正常细胞对照组和病毒对照组。　　　　1.2.2 动物实验研究　　　　1.2.2.1 动物分组及标本采集　　　　BALB/c 小鼠随机分为6 组，正常对照组（A 组40 只），病毒对照组（B 组50 只），中药治疗组（C 组50 只），病毒唑和VitC 对照组（D 组50 只）。实验当日正常对照组腹腔接种RPMI1640 培养液0.15ml，其他组腹腔接种TCID50109/mlCVB3 病毒液0.15ml。根据人与小鼠的标准公斤体重剂量折算方法[1]换算得小鼠的中药每日用量5.4g/kg，中药用小鼠消毒饮用水制成均匀混悬液，0.1ml 灌胃，A、B 两组用同体积的生理盐水灌胃。F 组小鼠病毒唑每日肌注0.1g/kg，VitC 灌胃1.5g/kg。病毒接种1 小时后开始用药，每日1 次，连用14 天。 接种病毒后第7、14 天每组随机处死10 只小鼠，21 天B 组处死剩余9 只小鼠，其它组处死10只小鼠，无菌取心脏，部分-80℃保存用于PCR 检测，部分用10%中性甲醛固定，待做光镜检查。　　　　1.2.2.2 病理学检查　　　　小鼠心肌标本常规石蜡包埋，HE 染色，光镜下观察心肌病理变化，并计算心肌病理积分：即每张切片随机取5 个高倍视野，计算每个视野中炎性细胞浸润及坏死区域面积与整个视野面积之比，无病变计0 分，病变面积﹤25%计1 分，25%～50%计2 分，50%～75%计3 分，﹥75%计4 分。　　　　1.2.2