促甲状腺素受体膜外区(hTSHRECD)在大肠杆菌中的表达和纯化论文.docVIP

　　促甲状腺素受体膜外区(hTSHRECD)在大肠杆菌中的表达和纯化论文 【摘要】 目的 用大肠杆菌表达重组人促甲状腺素受体膜外区(hTSHRECD)蛋白，为hTSHR膜外区的研究提供工具。方法 从人甲状腺组织中提取总RNA，RTPCR分离得到TSHR膜外区cDNA，双酶切后插入原核表达载体pRSET C中, 进行序列分析;再转化到表达菌BL21中表达、 纯化、ethods Total RNA human thyroid, hTSHRECD cDNA id pRSET C，and expressed in a soluble form in E. Coli BL21.Results There olecular an TSHRECD; RTPCR; purify protein 促甲状腺激素（thyroidstimulating hormone, TSH）是由垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素，主要作用的靶器官是甲状腺，它与甲状腺细胞膜上特异的受体即促甲状腺激素受体(thyrotropin receptor, TSHR)结合后，提高甲状腺的摄碘能力.freelmune thyroid disease, AITD)发病过程中，促甲状腺激素受体(thyrotropin receptor,.freel、Access RTPCR System、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和发光试剂盒为Promega公司产品;兔抗TSHR是上海亚培生物科技有限公司产品;质粒提取及凝胶回收试剂盒为上海博亚生物公司产品。 1.2 PCR引物的设计合成 根据文献报告人促甲状腺激素受体cDNA 序列资料［2］，由上海华诺生物科技有限公司设计并合成一对用于扩增 hTSHR 膜外区cDNA 编码区的寡核苷酸特异性引物：上游引物为5′CAACTCGAG ACCATGCTGGGCGGAATGGGGTGTTCG3′，它包涵有转录启动子、Kozak系列和Xho Ⅰ酶切位点;下游引物为5′TACGAATTCCTACAGGAACTTGTAGCCCAT TAT3′, 它包涵有转录终止子和EcoR Ⅰ酶切位点。 1.3 总RNA的提取和RTPCR 冻存的约100 mg甲状腺组织在盛有液氮的研钵中充分破碎，研磨成匀浆，按试剂盒说明逐步加入裂解液醋酸钠、酚氯仿异丙醇，抽提组织中的总RNA，经乙醇漂洗后溶于无RNA酶灭菌去离子水。利用分光光度器测定RNA的A260和A280值。RNA样品预处理于75 ℃变性5 min后速放冰上冷却。RTPCR反应体系：AMV反转录酶(5 u/μL)1 μL， DNA聚合酶(5 u/μL)1 μL，5×AMV/ Buffer 10 μL，上下游引物各3 μL，最后混合RNA样品加无RNA酶灭菌去离子水至50 μL。混匀后置PCR仪上，逆转录反应条件设为：48 ℃逆转录60 min，94 ℃预变性2 min。PCR反应条件为：94 ℃变性30 s，60 ℃退火60 s，68 ℃延伸270 s，45个循环后，68 ℃终延伸10 min。对RTPCR产物经乙醇沉淀法进行纯化浓缩。 1.4 克隆质粒和原核表达载体的构建及鉴定 促甲状腺素受体膜外区(hTSHRECD)在大肠杆菌中的表达和纯化根据TA克隆原理［3］,将TSHR膜外区片段插入pMD18T克隆载体。将TSHR膜外区(thyrotropin receptor ectodomain, TSHRECD)片段3 μL(约75 ng DNA)，TA克隆载体1 μL(约50 ng DNA)，T4 DNA连接酶0.5 μL，10×连接酶缓冲液5 μL，加去离子水至10 μL，至PCR仪上16 ℃过夜。将连接产物转入DH5α细菌，经IGTP/Xgal平皿(Amp+)筛选，挑选单个阳性菌落，放入10 mL LB培养液中，37 ℃振摇过夜。碱裂解法提取重组质粒，双酶切法筛选携带目的片段的阳性克隆子并纯化。将提纯的pMD18T ETSHR重组质粒双酶切后，定向插入质粒。反应体系为pMD18TTSHRECD重组质粒5 μL，10× Buffer 2 μL，Xho Ⅰ和EcoRⅠ各1 μL，加水至10 μL。将酶切体系37 ℃过夜，65 ℃ 15 min灭活内切酶。经凝胶电泳后分离目的片段ETSHR，提纯浓缩后加入原核表达载体pRSETC(EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切)，再建立连接体系。连接产物导入感受态细胞，涂于琼脂平板(Amp+)，挑选阳性克隆，EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ酶切鉴定分析后，送上海华诺生物科技公司测序。测序正确质粒命名为pRSETcTSHRECD。 1.5 TSHRECD融合蛋白的诱导表达 将重组质粒pRSETcTSHR