冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞CNE2的抑制作用论文.docVIP

　　冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞CNE2的抑制作用论文 朱国臣，肖大江，张亚男，吴四海，袁渊，黄红宇，魏云玉 【摘要】 目的探讨冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞E2的抑制作用，为其临床应用提供理论依据。方法SRB法检测冬凌草甲素对E2细胞生长的抑制作用.freelore effectively chemotherapeutic agents and treatment regimens, an nasopharyngeal cancer line E-2. MethodsCell groediated by Oridonin on E-2 cells ined by floetry . ResultsThe groan nasopharyngeal cancer line E-2 ainly necrotic cells and apoptotic cells . “SubG1” phase peak etry . Oridonin could cause E 2 cells cycle to change. phase cell percentage increased. ConclusionApoptosis and necrosis are the key mechanism for Oridonins killing action in human nasopharyngeal cancer line E 2, an Nasopharyngeal Cancer； Apoptosis； Necrosis 冬凌草甲素(oridonin)是从冬凌草中提取出来的有效抗癌成分，其主要化学结构是一种四环二萜类化合物，有研究表明其对白血病以及食管癌、肝癌、结肠癌等有一定的疗效［1～4］。本研究通过SRB法检测细胞存活率、流式细胞仪分析细胞周期的变化、检测细胞凋亡的发生等手段观察冬凌草甲素对于人鼻咽癌细胞E2株的抑制作用，以期为临床应用提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料和仪器 人鼻咽癌细胞系E2购于中国科学院上海细胞生物所，冬凌草甲素（纯度＞98%）购于中国科学院昆明植物研究所，Annexin V凋亡检测试剂盒购于Biovision公司， PI（碘化丙啶）购于Sigma公司，荧光显微镜为Leica公司产品，流式细胞仪为Beckman Coulter公司产品。 1.2 细胞培养细胞培养基为RPMI1640（美国Gibco BRL公司），补充10%胎牛血清（杭州四季青公司）、100IU/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素。细胞培养用50 ml培养瓶，置于37℃，5% CO2培养箱在全湿条件下培养。 1.3 SRB法检测细胞存活率将增殖良好并处于对数生长期的E2细胞经0.25%胰酶及EDTA各半的消化液分散后计数，制成细胞悬液，接种于96孔板内，100 μl/孔。预培养24 h后，每孔加入不同浓度的冬凌草甲素100 μl/孔（6.25，12.5，25，50，75，100，200 μmol/L）每个药物浓度设6个复孔，并设空白对照(RPMI 1640培养液)和正常对照（不加药物，加等量生理盐水），置于37℃，5%CO2培养箱在全湿条件下培养48 h。然后参照Skehans法，取出培养板，每孔加入50%的三氯醋酸50μl固定细胞，然后在4℃冰箱中放置1 h。三蒸水洗涤、干燥后，每孔加入0.4%SRB100 μl，室温下放置30 min，弃去各孔内液体后用1%乙酸洗涤5遍，干燥后用pH为10.5的10 mmol/L三羟甲基胺基甲烷溶解，在平板振荡器上振荡5 min，在酶联免疫检测仪上测定A值，用空白对照调零，所用波长509 nm。计算出药物对细胞生长抑制率。生长抑制率=(对照组A值实验组A值) /对照组A值×100%。 1.4 流式细胞仪检测 1.4.1 Annexin V标记检测收集不同浓度药物作用后的细胞，分别制备成0.5 ml PBS单细胞悬液，先后加入凋亡试剂盒中Annexin VFITC和 PI各5 μl，室温下避光染色10 min，上流式细胞仪检测，软件分析结果。未加药组为对照组。 1.4.2 细胞周期检测收集不同浓度药物作用后的细胞，70%冷乙醇固定过夜，PBS清洗，200 μl RnaseA 37℃水浴消化30 min，800 μl PI避光染色30 min，上流式细胞仪进行细胞周期和凋亡峰检测。未加药组为对照组。 1.5 统计学分析 所得数据经SPSS 10.0 for ol/L浓度时，E细胞的抑制率分别为4.56%，13.78%，53.51%，68.92%，77.84%，91.26%。可以看出冬凌草甲素对E-2细胞生长抑制率随着浓度的增加而增加，冬凌草甲素的半数抑制率IR50为24