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Advanced Enzyme Engineering 第九章 生物酶工程 Contents 生物酶工程是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，亦称高级酶工程(Advanced Enzyme Engineering)。 二、 生物酶工程的内容 （3） 从蛋白质或基因水平上设计，合成酶杂合体或自然界不曾有的酶（杂合酶）。 通过基因工程手段，克隆各种天然酶的基因，将其克隆到表达载体中，然后将表达载体转化到适当的宿主中，得到表达特定酶的基因工程菌，通过基因工程菌的繁殖大量产生的酶称为克隆酶。 外源基因转入微生物宿主细胞内，与宿主细胞的遗传物质相结合，后代宿主的遗传物质中含有外源基因，这种带上人工赋予的新的遗传特性的宿主微生物，被称为基因工程菌。 （2）克隆酶对载体的要求 （1）在宿主细胞内可以自主复制； （3）克隆酶对宿主的要求 （1）安全可靠，非致病菌； （4）克隆酶基因的表达系统 原核生物的基因表达系统 真核生物的基因表达系统 1. 酵母表达系统 2. 植物表达系统 3. 动物表达系统 4. 丝状真菌表达系统 （5） 克隆酶实例 纤维素酶基因工程菌的构建 纤维素酶 纤维素酶在食品、饲料、造纸、纺织等行业具有广泛的用途。但由于天然纤维素酶产量低、来源有限而导致其大规模应用受到限制。 为此，通过基因工程技术，克隆福寿螺体内的纤维素酶基因，构建含有cel的基因工程菌，以期通过液体培养或固体培养的方式得到大量的克隆纤维素酶。 技术路线1 技术路线2 2. 突变酶 定义：利用有控制地对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，从而改变这些酶的催化特性、底物专一性或稳定性，使之更加符合人们的需要。 遗传修饰改变酶的性能大致有： （1）提高酶的活性 （2）提高酶的稳定性 （3）改变底物专一性 （4）改变酶的最适pH值 （5）改变酶对辅酶的要求 （6）改变酶的别构调节能力 修饰酶基因的方法主要方法 （i）定位突变 （ii）体外定向进化 定位突变（site-directed mutagenesis）是根据酶的结构、功能和作用机制的信息，在基因水平上精确改变酶分子中的氨基酸残基，对酶的性质和其催化特性进行改造，产生符合特定需要的酶。 盒式诱变 寡聚苷酸引物诱变 PCR诱变 （1）盒式诱变 原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡聚核甘酸片段（寡核甘酸盒，Oligonucleotide Cassette），取代野生型基因中的相应序列。 （2）寡聚苷酸引物诱变 原理：用化学合成的含有突变碱基的寡核甘酸短片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，生产出来的新链中目的基因的特定位点具有已经发生突变的碱基序列。 （3）PCR诱变 定点诱变法 大引物诱变法 原理：在头两轮的PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，两者在其重叠区段具有同样的突变。故此两条双链DNA片段经变性和退火处理，形成两种不同形式的异源双链分子。然后选用两个外测寡核甘酸引物进行第三轮PCR扩增，可得到一种含有突变位点的突变体DNA。 一．理论来源 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程 化学进化 生物进化 人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶的分子进化技术称为体外定向进化。 定向进化示意图 随机突变+定向选择＝目标突变体 定向进化 属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。 定向进化＝随机突变＋选择 澄清一个事实：定向进化不是定点突变 定向进化：突变 筛选 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。 定点突变： 突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。 易错PCR技术(er