zhuzhu血红蛋白的提取与分离.pptVIP

补充：蛋白质的性质 两性电解质：可表现酸性也可表现碱性，因为既含酸性基团——羧基，又含碱性基团——氨基 可溶于水，呈胶体状 盐析：向蛋白质溶液加高浓度无机盐，蛋白质以沉淀析出，再加水稀释，沉淀消失，蛋白质溶解。此过程可逆，不影响蛋白质性质 变性：强酸，强碱，高温，重金属作用下蛋白质的空间结构被破坏，蛋白质变性。 思考 高温灭菌和酒精消毒分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？（ ） A、变性、变性、空间结构 B、分解、变性、化学结构 C、变性、变性、平面结构 D、分解、分解、空间结构 看书：64、65页，思考以下问题： 1、蛋白质分离的依据是什么？方法是什么？ 2凝胶色谱法分离蛋白的依据是什么？原理又是什么？其过程怎样？ 3缓冲液的作用是什么？如何配制？又有何实践意义？ 使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程,可表示为图中?? （??? ） 有关缓冲溶液的说法不正确的是(　) A．缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变 B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成 C．调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液 D．生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行 思考 为何使用PH=7的磷酸缓冲液中透析？为什么缓冲溶液的量远多于血红蛋白溶液量？ 蛋白质提取和分离分为哪几步（ ） A. 样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 B. 样品处理、凝胶色谱操作、纯化 C. 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D. 样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定 c、吸取血浆：上层透明的黄色血浆 d、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤 f、低速离心（低速短时间） i、重复4、5、6步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净 e、缓慢搅拌10分钟 ②血红蛋白的释放 加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白 ③分离血红蛋白溶液 A、过程 a、将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min 第1层（最上层）：甲苯层（无色透明） 第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体） 第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体） 第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色） b、试管中溶液层次 用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体 ③分离 取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时 ④粗分离—透析 除去样品中分子量较小的杂质 ①过程 ②透析目的 目的：为了维持血红蛋白的正常特性。 因为：有利于杂质分子充分地向外扩散。 2、纯化——凝胶色谱法 （1）凝胶色谱柱的制作 ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平 ②底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底 注意事项： ⑤安装其他附属结构 ③顶塞的制作 打孔 安装玻璃管 ④组装 将上述三者按相应位置组装成一个整体 （2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择 A、材料 “G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克 B、代表意义： 交联葡聚糖凝胶（G-75） 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至沸腾，通常只需1-2h,可节约时间，也可除去凝胶中的微生物和气泡 ②凝胶的预处理 ③凝胶色谱柱的装填方法 A、固定 B、装填 将色谱柱垂直固定在支架上 将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀 注意： 2、装填凝胶柱时不得气泡存在： 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙 装填完连接 洗脱瓶 约50厘米操作压 1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果 注意： 2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm 高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时 ④洗涤平衡 （3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面 ②滴加透析样品 吸管吸1ml样品加到色谱柱的