断试剂盒使用中常见问题及解决方法.pdfVIP

214国家星火培训计划及国家农业行业科技：箜±二昼全望燮丝猹扬圭墨壅瘟鉴揎皇垒丝童壁塑过金迨塞煎造 EUSA诊断试剂盒使用中常见问题及解决方法 卢 顺，董晓辉，但汉并，郭学波，郭小峰，张春娟，杜红亮，王绍关 (武汉科前动物生物制品有限责任公司，武汉430070) 酶联免疫吸附试验(ELISA)技术自问世以来，因其所需仪器化程度低、操作简便、敏感度高、特异性强、 特别适合于对大量样本的筛检工作等优点在兽医临床检验中被广泛地应用。但ELISA测定中影响因素较多， 而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时也会得到一些错误的结果。笔者在 ELISA试剂盒的研发和应用过程中对经常出现的一些问题进行了分析和总结，现对ELISA试剂盒在使用过 程中出现的一些问题谈一点自己的见解，希望对广大同行及试验操作者有所帮助。 1 引起ELISA测定结果错误的主要因素分析 1．1样品因素 1．1．1样品的内源性因素 样品的内源性因素包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体 等。这类因子在ELISA测定中，可与固相载体上包被的特异性抗体或抗原结合，从而出现假阳性结果。用 ELISA试剂盒检测样品时应当使用专用的样品稀释液稀释样品，以减少非特异性反应。 1．1．2样品的外源性因素 外源性干扰因素包括样品溶血、样品被细菌污染、样品保存时间过长和样品凝固不全等。溶血的血清 样品中所含铁血红素有类似过氧化物酶的活性，因此在以辣根过氧化物酶(HRP)为标志的ELISA测定中， 如果血清样本中的血红蛋白浓度较高，则很容易在温育过程中吸附于固相载体上，从而催化HRP底物发生 显色反应。所以在采血和分离血清时，应注意防JI：样品出现溶血。样品的污染菌体可能含有内源性辣根过 氧化物酶，也可使实验出现非特异性显色。因此，ELISA检测宜采集新鲜样品，如不能当时测定，应低温 冻存，尽量避免样品的污染。 血清样品在冰箱中保存过久，其中的IgG可聚合成多聚体，在用间接法测定中会导致本底过深，甚至 造成假阳性。反复冻融产生的机械剪切力会破坏样品中的蛋白等分子，引起假阴性结果，因此冻存样品要 尽量避免反复冻融。 1．2试剂因素 试剂盒在出售前都要经过质量检验，一般来说试剂不会出现质量问题。但值得注意的是，不可使用过 期的试剂和混用不同批号的试剂，如发现试剂颜色不正常。应停止使用。试剂盒在使用前通常要平衡至室 温(约25℃)，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的检测需求。一般 的做法是在室温放置20--30分钟以上。平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA 国家星火培训计划及国家农业行业科技：第十一届全国规模化猿扬主要蕉瘟堕鳖皇净业专题研讨会论文摘选 215 反应不够充分。冬季室温低，可将试剂盒置37C温箱10分钟。如果从冷藏室拿出来就检测，其直接的后 果是对一些弱阳性样品的检测出现假阴性。 稀释试剂用的水要符合试剂盒说明书的要求，通常使用双蒸水或去离子水。使用的水含有过多杂质或 酸碱度不符都会影响检测结果。 1．3操作因素 1．3．1样品稀释 酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果待检的血清样品不稀释，不可避免会产生很强的非特异 性反应，出现假阳性。因此，国内外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非 特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以 保证试验的灵敏度和特异性。但是，有些操作者未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取5ul样品进 行稀释，如果取2ul甚至更少样品进行稀释，由于吸头上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够， 会造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也 须摇匀，以保证试验的均一性。 1．3．2加样 加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性 和均一性。如果加在孔壁上部的非包被区，可能导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则 反应液界面有差异。所以，有时候一份样品用相同的试剂盒重复两次出现两个不同的结果，往往就是加样 及试剂的错误造成的。此外，要做到一份样本一个移液头，防止交叉污染。 1．3．3温育 温育是ELISA测定中比较关键的一个因素。ELISA作为一种固相载体免疫测定技术，抗原抗体的结合 反应在固相载体上进行，要使液相中的抗原或抗体