中枢神经元烟碱型乙酰胆碱受体的显示方法论文.docVIP

　　中枢神经元烟碱型乙酰胆碱受体的显示方法论文 .freelyasthenia gravis Abstract:AIM To study the method of expression of neu-ronal nicotinic acetylcholine receptor by acetylcholine receptor antibody purified from myasthenia gravis serum.METHODS ELISA assay -munoaffinity tomography method and munoreaction bet neuronal nicotinic acetylcholine re┐ceptor.RESULTS The positive immunoreaction bet，for instance.freel motor necleus and spinal motor neurons.The distribution pattern ethods.CONCLUSION AChRab from MG can crossreact AChR和神经-nAChR.目前用原位杂交和抗神经-nAChRα和β亚单位亚型单抗免疫组化法来研究S中神经-nAChR各亚型的分布及其与某些疾病发病机制之间的关系，但技术操作繁琐，不易广泛推广应用. 分析肌和神经-nAChR亚型基因组成和结构，发现两者均属于配体-门控-离子通道基因家族，两者的同源性达80%～90%［4］ .重症肌无力（MG）的AChRab可特异性地与肌-nAChRα-亚单位主要免疫区结合［5，6］ .因此，AChRab也有可能与S中的神经-nAChR免疫交叉结合，选择性地显示神经-nAChR.本项研究，先提取纯化AChRab，然后利用免疫组化法探讨AChRab与鼠S神经-nAChR之间的免疫结合反应，旨在建立一种简便易行的显示S神经-nAChR的方法. 1 材料和方法 1.1 提取和纯化 AChRab根据典型的MG症状，阳性的抗胆碱酯酶药物试验和血清中AChRab滴度测定结果诊断MG.利用Protein G（Sigma），从3例AChRab阳性的全身型MG患者血中提取纯化AChRab.3名健康者为正常对照. 1.2 免疫组化 选成年SD大鼠各20只，平均体质量250～300g.用戊巴比妥深度麻醉，左心插管，用40g L-1 的冷（4℃）多聚甲醛液400mL灌注固定20～30min;迅速取脑，入200g L-1 蔗糖溶液1d.取全脑续列冰冻切片，40μm厚，入3g L-1 TritonX-100，室温下30min，然后用KPBS（0.01mol L-1 ）洗3次，15min/次;然后分别用AChRab（KPBS1 100稀释）和从健康人血中提取的IgG，4℃下孵育48h，KPBS洗3次，15min/次;用生物素化羊抗人-IgG（武汉博士德公司）室温下孵育切片4h，KPBS洗3次，15min/次;最后用生物素-亲和素（Sigma）室温下孵育切片3h，KPBS洗3次，15min/次.用二甲基联苯铵-硫酸镍铵加强法呈色，适时终止反应. 2 结果 免疫组化结果显示，AChRab和神经元-nAChR之间的阳性免疫结合反应弥散地分布于鼠S许多部位.各部位神经元-nAChR样阳性免疫结合反应强弱有别，有些部位呈强阳性，而在另一些部位则呈中等或弱阳性反应，甚至无阳性反应.大脑皮层除分子层中无阳性反应外，第Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ及Ⅵ层中均有神经元-nAChR样阳性免疫结合反应，其中第V层大锥体细胞呈强阳性反应，并发出长长的突起伸向皮层表面，至第皮层Ⅱ和Ⅲ层，而第Ⅳ层阳性反应神经元相对稀少（Fig1A）;梨状皮层部分神经元也呈强阳性反应;海马皮层锥体细胞胞体呈较强阳性反应，突起阳性反应相对弱，而且海马不同区，如CA1，CA2及CA3区阳性反应强度不尽相同;丘脑各核团神经元呈中等阳性反应，而在丘脑网状核中却能看到边界清楚着色较深的强阳性反应神经元（Fig1B）;下丘脑室旁核、视上核（Fig1C）、中脑黑质致密部（Fig1D）、三叉神经中脑核（Fig1E）等均呈强阳性反应;脑干颅神经核团呈中-强阳性反应，如面神经核（Fig1F）;脑干网状结构巨细胞部神经元胞体及突起呈强阳性反应，可看到许多清晰的突起伸向邻近结构（Fig1G）;在小脑可看到轮廓清晰的浦肯野细胞胞体及伸向小脑皮层的突起，呈强阳性，而在颗粒层中却没有见到阳性免疫结合反应（Fig1H）. 图1 略 3 讨论 3.1 AChRab与肌和神经┐nAChR之间的免疫反应机制 肌-nAChR是由2α1，β2，，δ亚单位组成的五聚体.用肌-nAC