第四章 抗体制456节.ppt

⑶制备方法 先克隆毒素基因，再利用基因重组技术去除毒素中非特异性细胞结合部位基因。经改造的毒素基因再与载体基因cDNA重组，转入受体菌中表达，形成融合蛋白，再经过纯化就得到重组免疫毒素。 ⒊ 免疫毒素的临床应用 治疗肿瘤、自身免疫病、并能克复组织移植排斥反应。由于重组免疫毒素是在胞浆物质代谢中发挥作用，相对分子质量又小，渗透力强，所以效果好。 随着技术的进步，越来越多的抗体走向临床，成为攻克疾病的有力武器。根据互联网（）的资料统计（2000年），在369种进行临床研究（pipeline）的生物药品中，抗体就占了59种，是除疫苗以外种类最多的。抗体可变区序列的多样性决定其结合抗原的特异性，因而比较容易形成自己的专利，比其他产品有更广阔的开发余地。 第四章 抗体制药思考题（2） 1、建立噬菌体抗体库的基本方法是什么？请列出建立噬菌体抗体库的技术流程 2、耐药性产生的机理是什么？ 3、常用的抗体诊断试剂和抗体治疗药物分别有哪几类？ 第四节 基因工程抗体和抗体工程 抗体研究进展3个阶段： 　①1890年Behring发现白喉抗毒 素，特点：多克隆抗体； 　②1975年Kǒhler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体； 　③1994年Winter基因工程方法制备抗体。 Winter等人建立了噬菌体抗体库，克服了人体不能随意免疫的缺点，用人的外周血制备抗体文库，获得了人源性基因工程抗体。 在此之前，基因工程抗体技术只能对已有的单体进行改造，而抗体库技术的诞生却可以不通过动物免疫和细胞融合便可以从抗体库中筛选得到全新的人源化的抗体，并通过细菌发酵或转基因动植物生产出来。抗体库技术的发展使得抗体工程技术进入了一个全新的时期。 抗体库技术的生产与发展基础在于两项关键技术的突破，一是PCR技术的应用使得人们可以利用一组引物扩增出全套免疫球蛋白的可变区的基因；二是从大肠杆菌中直接表达出有功能活性的抗体分子片段。基因原理是将某种动物的所有抗体可变区的基因克隆在质粒或噬菌体载体中进行表达，分泌，然后通过特定的固相化抗原便可筛选出高度特异性抗体基因的克隆。该抗体库又称全套抗体库或组合抗体库。 用基因工程的方法可以将抗体基因的克隆和表达融为一体，同在一种载体上进行，将抗体基因表达在载体的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，在数日内就可筛选出阳性克隆。 一、噬菌体抗体库技术的基本方法 ⒈ 获取目的基因（RT-PCR） ⒉ 抗体库技术的载体（噬菌粒phagemid为载体） 具有噬菌体与质粒特点、转化效率高、库容量大 ⒊ 淘筛抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增。 ⒋ 表达与鉴定 （Western blot） 噬菌体抗体库的技术流程 采集淋巴细胞，杂交瘤细胞株等 提取mRNA RT-PCR获得VH，VL基因 构建分别表达VH，VL的载体 扩增后克隆至同一噬菌体 转化至大肠杆菌 或其他表达系统 筛选特异性抗体并富集 抗体的体外亲和力成熟 二、噬菌体抗体库技术的特点 ⒈ 模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能包含B细胞全部克隆 ⒉ 避开了人工免疫和杂交瘤技术 可以调出任意抗体基因 ⒊ 可获得高亲和力的人源化抗体 抗体基因来自人体 三、基因工程抗体表达 ⒈ 原核细胞表达（大肠杆菌） ⒉ 真核细胞表达 （酵母菌） ⒊ 转基因植物表达（烟草） ⒋ 转基因动物表达（鼠） 第五节 抗体诊断试剂 一、血清学鉴定用的抗体类试剂 血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定。常用的方法是凝集反应。 ⒈ 鉴定病原菌的抗体试剂 ⑴ 常用诊断血清的品种和用途 ①沙门氏菌属诊断血清 ②志贺氏菌属诊断血清 ③病原性大肠埃希氏菌诊断血清 ⑵ 诊断血清的制备步骤 　①制备细菌抗原 　②免疫动物和制备抗体血清 ⑶ 诊断血清诊断方法—直接凝集反应 ⒉ 乙型肝炎病毒表面抗原的 反向被动血凝诊断试剂 ⒊ 妊娠诊断试剂 ⒋ 抗ABO血型系统血清 二、免疫标记技术用的抗体类试剂 能将抗原抗体反应放大，使常规方法不能观察的反应得以显现，因而大幅度提高抗原抗体反应的敏感性，用于对微量抗原物质进行定性或定量检测。 ⒈ 荧光抗体诊断试剂 ⑴荧光抗体的制备 ⑵免疫荧光测定方法 ⒉ 免疫酶抗体诊断试剂 ⑴免疫酶染色法用抗体诊断试剂 ⑵酶免疫测定用抗体诊断试剂 ①HBsAg酶标诊断试剂 ②HBeAg酶标诊断试剂 ③HAVAg（甲型肝炎病毒抗原） 酶标诊断试剂 ④测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗 原的酶标抗体诊断试剂 ⑤甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊 断试剂 ⑥癌胚抗原（CE