半定量技术医.docVIP

高等生物基因表达的变化是调控细胞生命活 动的核心机制，正是由于基因的差异表达才决定 了生物体的所有生命过程。因此，研究不同类型细 胞或同一类细胞在不同发育时期或不同发育状态 下基因表达的变化，已成为当今生物学的研究热 列无关的管家基因，如Ｂ一肌动蛋白（ｐ—ａｃｔｉｎ）和 甘油一３一磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）等，因为这些基因 的转录比较稳定，含量相对丰富。将ＲＮＡ逆转录 为ｃＤＮＡ后，使靶基因和“管家基因”在同管或异 管中一起扩增，在对扩增产物进行分析时，首先根据各样本间“管家基因”扩增条带密度是否一致， 粗略地判断各样本抽提的效率、质量和扩增效率 是否一致，然后以“管家基因”扩增产物条带的密 度作为标准，计算出靶基因扩增条带密度与其之 点之－－〔１１。半定量逆转录多聚合酶链式反应（ＲＴ— ＰＣＲ，Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａｅ－ ｔｉｏｎ）技术是近年来发展起来的探讨基因转录水平 的有效手段ｆ２】。与传统的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ法比较，它具有灵敏、简捷、特异性高等优点，因此在检测基 因的表达水平上得到了广泛的应用。 比值，并通过观察各样本扩增产物的比值，得出靶基因的表达量的相对变化【３】。 １原理 ２反应参数 半定量ＲＴ—ＰＣＲ技术的核心即ＰＣＲ，是２０世 纪８０年代末出现的一种相对定量的技术。当人们 ２．１ ＲＮＡ的质量 在运用半定量ＲＴ—ＰＣＲ方法检测特异基因表 达量的差异时，总ＲＮＡ的质量至关重要，只有在 总ＲＮＡ未被降解的情况下，才能保证其中ｍＲＮＡ 的完整性，从而真实反映起始模板中基因表达量 的差异１４Ｊ。因此，每个ＲＮＡ样品须检查其完整性 和纯度，可以通过琼脂糖或甲醛变性电泳分析证 明总ＲＮＡ的完整性，一般在电泳图上会出现两条 欲利用该技术研究并揭示某一基因的表达产物量的改变时，利用相同量的ＲＮＡ进行反转录后，再 ＰＣＲ扩增，然后将扩增产物进行电泳判断量的差 异。为避免样本间模板质量和扩增效率的差异而 导致最终结果的差异，在ＰＣＲ反应体系中引人了 内对照系统。在一般情况下大多选用与靶基因序 收稿日期：２００７—０３—２７修订１３期：２００７—１２—１０ 作者简介：金凤媚（１９７７一），女，天津人。助理研究员，主要从事番茄分子育种研究。 万 　 方数据 第１期 金凤媚等：半定量ＲＴ—ＰＣＲ技术的研究及应用 带２８Ｓ和１８Ｓ，且２８Ｓ的亮度应是１８Ｓ的两倍【５】。 半定量ＲＴ—ＰＣＲ检测体系必须防止混在ＲＮＡ中 的基因组ＤＮＡ带来的假阳性，所以在抽提后一定 要用ＤＮＡ酶消解残存在样品中的ＤＮＡ。 ２．２逆转录（ＲＴ） 逆转录酶ＡＭＶ或Ｍ—ＭＬＶ能有效地逆转录 ＲＮＡ，合成模板ｃＤＮＡ，加Ｒｎａｓｉｎ（ＲＮＡ酶抑制 剂），可获得最高产量。实验证明，ｃＤＮＡ合成后残 留的完整ｍＲＮＡ模板干扰ＲＴ—ＰＣＲ，因为它与 ｃＤＮＡ竞争作为ＰＣＲ模板【６１，而ＡＭＶ和Ｍ—ＭＬＶ 反转录酶的内在ＲＮａｓｅＨ活性足以降解残存的大 多数ｍＲＮＡ模板。但使用缺乏ＲｎａｓｅＨ活性的反 转录酶时，则必须用ＲｎａｓｅＨ处理ｃＤＮＡ。 在逆转录过程中另一个需要考虑的情况是低 拷贝ＲＮＡ的反转录效率要低于高拷贝ＲＮＡ，尤 其是在反转录过程中存在大量非特异和背景 ＲＮＡ时，这种情况更为明显，因此反转录过程中 基因表达的实际情况…。２．４ Ｍ矛＋浓度对扩增效率的影响 Ｍ９２＋是影响Ｔａｑ酶扩增效率的重要因素，浓 度范围在０．５～５ ｍｍｏｌ／Ｌ，但扩增效率视序列而定。 徐春兰等【１３】的研究表明Ｍｇ：＋对细胞谷胱甘肽过氧 化物酶基因扩增的影响较大，浓度在０．５～１ｍｍｏｌ／ Ｌ时，扩增效率不理想，条带较淡，进一步应用分 析软件对电泳条带ＩＯＤ值进行分析时发现，在１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ时扩增效率及特异性良好。而对于小 麦硫蛋白基因的检测结果，能同时稳定扩增目的 基因和内参的Ｍ９２＋浓度分别为１．７ ｍｍｏｌ／Ｌ和１．９ｍｍｏｌ／Ｌｔ叭ｏ ２．５引物的影响 ２．５．１引物问的竞争利用ＲＴ—ＰＣＲ技术对ｍＲＮＡ 进行检测时一般要在同一管中对内参照和目的基 因进行扩增。要在同一管中有效扩增出内参照和 目的基因产物，并在凝胶电泳上清晰显现，同时消 除引物对间可能的竞争，在设计引物时，除满足引 物设计的基本要求外，还应考虑引物扩增的预期 退火温度，特异基因和内参照引物的预期退火温 度尽量相符；引物序列进行比对时，二者应无同源 性；产物长度应有一定差异，以免电泳时重叠。如 果目的基因与内参基因的扩增动态曲线表明，二 者处于线性期的循环次数相差过大，却直接同管 扩增，则两者的产物量受到竞争，扩增效率降低， 这时可选用同批异管扩增，并在不同循环次数下 分别取出二产物【９】。 ２．５．２引物的设计在选择ＰＣＲ引物时，尽量使