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* 课题5 制备和应用固定化酶 1.直接应用酶生产的缺点。 2.固定化酶的概念及优点。 3.固定化酶的方法。 4.固定化酶多采用的方法及原因。 5.固定化细胞的优点和缺点。 6.固定化细胞常用的方法及原因。 7.活化酵母细胞的含义及注意事项。 8.配制CaCl2溶液的注意事项。 9.配制海藻酸钠溶液的加热方法及海藻酸钠浓度过高和过低造成的后果。 10.海藻酸钠溶液与酵母细胞混合的注意事项。 思考：直接应用酶生产的缺点？ 一、固定化酶技术 酶的稳定性差，通常在强酸、强碱、高温和重金属离子等因素的影响下容易失活； 溶液中的酶很难回收,不能被再次利用,提高了生产成本; 反应后酶会混在产物中,可能影响产品质量。 (一)固定化酶技术产生背景： 2、固定化酶技术的优点： 将酶固定在不溶于水的载体上,使酶既能与反应物接触,又能与产物分离, 可以被反复利用。 微生物产生的酶，可以分为分泌在细胞外的胞外酶和包含在细胞内的胞内酶。利用胞内酶时，需要采用手段将细胞破碎后，将酶进行分离纯化，提取后酶的活性和稳定性往往都受到很大的影响。 (二)固定化酶技术 1、固定化酶概念： 3、固定化酶应用实例： 应用固定化酶技术生产高果糖浆 ①生产原料:葡萄糖 ②生产机理：经葡萄糖异构酶的异构作用，将一部分葡萄糖转化成果糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖浆。 高果糖浆是指果糖含量为42%左右的糖浆。 使用固定化酶技术，将葡萄糖异构酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应液却可以自由出入。 生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触转化成果糖，从反应柱的下端流出。 ③生产过程 ④生产优点 反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。 4、固定酶(或细胞)的方法： 包括包埋法、化学结合法(将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上)和物理吸附法。 (1)包埋法 ①定义：将酶或细胞包埋在不溶于水的多孔性载体中，包埋成格子型或包埋成微胶囊型。 ②载体：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺。 交联法：通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。 (2)化学结合法 ①定义：将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到纤维素、琼脂糖，离子交换树脂等载体上的固定方式。 ②种类 共价结合法：酶和载体以共价键的形式结合在一起的方法，这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团。 (3)物理吸附法：将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等。 说明：酶和细胞固定方法的选择: (1)方法：①酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化②细胞多采用包埋法固定化 (2)原因：细胞个大，酶分子很小； 个体大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋的材料中漏出。 酶的几种固定方式 将酶吸附在载体表面上（物理吸附法） 将酶相互连接起来（化学结合法） 将酶包埋在细微网格里（包埋法） 二、固定化细胞技术 1、优点和缺点： 将合成酶的细胞直接固定。与固定化酶技术相比,固定化细胞制备的成本更低、周期短、产量大、操作更容易，固定一系列酶，対酶活性影响更小。 将微生物细胞限制或定位于特定空间位置，即将微生物制成固定化细胞后，能避免复杂的细胞破碎、酶的提取和纯化过程，因而固定化细胞内酶的活性基本没有损失。固定后的微生物细胞可以作为固体催化剂催化一系列反应，同时，催化反应结束后又能被回收和重复利用。 固定化细胞操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收等，但由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。 思考：根据所学课本内容想一想，固定化酶技术和固定化细胞技术这两种技术中 哪种技术先发展起来的？ 2、固定化细胞的方法： 吸附法和包埋法。 常用的方法是包埋法。 原因：细胞个大，酶分子很小； 个体大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋的材料中漏出。 三、酵母细胞的固定化技术 选用海藻酸钠作载体包埋酵母细胞 1、酵母细胞的活化 ① 过程：称取1g干酵母，放入50ml的小烧杯中，加入蒸馏水10ml。用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右，使其活化 活化：在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。 酵母细胞所需要的活化时间较短，一般需要0.5～1 h，需要提前做好准备。此外，酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。 ②注意事项 2、配制物质的量浓度为0.05mo