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烟草花药培养实验 * * 花药培养 一、花药培养的定义 花药培养: 将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。 二、花药培养的历史 20世纪60年代中期Guha和Maheshwari(1964，1966)首次报道由毛曼陀罗花药培养获得了大量花粉起源的单倍体以来，这项技术已被成功地推广到至少52个属的153个种，其中包括不少有重要经济价值的植物。 三、花药培养的意义 迅速获得纯合型材料，提高选择效率，缩短育种年限 获得育种中间材料 突变体选育 体细胞融合 获得染色体异附加系和代换系 遗传研究 遗传工程受体 1、取材 花药在接种以前，应预先用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗的大小、颜色等外部特征之间的对应关系。 一般而言，花粉处于单核后期的花药对 培养反应较好，在烟草中，此时花蕾的 花冠大约与萼片等长 四、花药培养的一般程序 2、预处理 适当的预处理可以显著提高花药的愈伤组织诱导率。常用的预处理方法是低温冷藏，具体的处理温度和时间长度因物种而异：烟草7～9℃，7～14 d；水稻7～1O℃，10～15 d；黑麦1～3℃，7～14 d；大麦3～7℃，7～14 d。但低温预处理对小麦效果不稳定，有时还有负效果。 四、花药培养的一般程序 3、消毒 花药适宜培养时，花蕾尚未开放，花药在花被或颖片的严密包被之中，本身处于无菌状态，因此，通常只要以70% 酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦穗的叶鞘表面，即可达到灭菌要求。 四、花药培养的一般程序 4、接种 把雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养，在整个操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。 由于花药对离体培养的反应存在“密度效应”，因此每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度。 四、花药培养的一般程序 5、培养方式 在琼脂固化培养基表面培养; 在加人30％Ficoll的液体培养基表面飘浮培养 利用固体一液体双层培养基培养，以便既能保持较高的接种密度，培养基又不易失水 四、花药培养的一般程序 6、培养条件 对于大多数小麦品种来说，在培养的最初6d给以30～32 ℃的较高温度，然后再转入28～30℃下培养。水稻花药培养的适宜温度从一开始就是27℃。 对光照的要求在物种间差异更为明显，例如连续光照可显著增加烟草花粉胚的产量，却强烈抑制曼陀罗的花粉胚胎发生。禾谷类植物在花粉愈伤组织诱导期间则以暗培养或散射光培养效果较好。 四、花药培养的一般程序 7、单倍体植株的二倍化 秋水仙素处理诱导染色体加倍： 禾本科植物，一般都是在分蘖盛期用秋水仙素溶液浸泡分蘖节； 把含有秋水仙素的羊毛脂涂于上部叶片的腋芽上，然后把主茎的顶芽去掉，以刺激侧芽长成二倍体的可育枝条。 采用愈伤组织和试管苗染色体加倍。把幼小的花粉植株浸于过滤灭菌的O.4％秋水仙素溶液中96h（烟草），然后转移到培养基上使其进一步生长。 四、花药培养的一般程序 五、影响雄核发育的因子 雄核发育指小孢子沿孢子体途径发育成花粉植株的过程。 基因型 生理状态：幼年植株的花药反应能力较好 花粉发育时期：一般而言单核后期花药对培养反应较好 药壁因子：花药壁对同一物种及不同物种离体花粉雄核发 育有看护作用。 培养基：基本培养基、碳源、植物激素、活性炭 一、实验目的： 掌握花药培养和外植体取材的方法 二、实验材料： 烟草的蕾期植株 烟草的蕾期植株 三、实验方法和步骤： 不同大小的烟草花蕾 1、取材与预处理：摘取花冠长度为21-23mm的花蕾（花冠与萼片等长，此时单核花粉行将完成第1次有丝分裂），置于7-9℃低温下预处理7天。 2、配制培养基 MS基本培养基，添加30克蔗糖，5克活性炭。 1号； 不加激素； 2号； 2，4-D 0.2mg/L + BA 0.1mg/L； 3、烟草花蕾表面消毒 　　将烟草花蕾在70%酒精中浸数秒，倒掉酒精， 再用0.1%升汞处理 8min后，无菌水冲洗4次。 三、实验方法和步骤：