实时定量PCR医.docVIP

实时定量PCR 一、基本原理 所谓实时定量PCR（real-time PCR）技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时定量PCR技术中，有一个很重要的概念，即：Ct值（C代表Cycle，t代表threshold），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时定量PCR中所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。（1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。（2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地参入DNA双链后，发射荧光信号，而不参入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 图2-3-4 用于检测MicroRNA前体的实时定量PCR引物设计 （引自Schmittgen TD, Jiang J, Liu Q, Yang L.A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors.Nucleic Acids Res.2004;32(4):e43.） 最初，实时定量PCR被用于定量检测小RNA前体的表达（图2-3-4）。与杂交方法相比，PCR方法可以高度灵敏地检测出低丰度表达的靶分子，并适于高通量筛选。PCR扩增前的逆转录反应可以使用随机引物或基因特异的引物，简要过程如下：首先将纯化的小分子量RNA与引物混合，经变性、复性过程使引物与模板配对；然后加入逆转录酶、底物、DTT、以及RNA酶抑制剂的混合物逆转录生成cDNA；再以cDNA为模板进行实时定量PCR。PCR引物设计遵循以下几个原则：（1）上下游引物都定位于小RNA前体的茎环结构上；（2）假设小RNA前体的3’或5’端与成熟小RNA相同（允许向假设的小RNA前体的末端扩充多至4个核苷酸）；（3）引物长度在18—24个核苷酸之间，退火温度在49—59℃之间，3’端不要出现GC等。 图2-3-5 TaqMan成熟miRNA实时定量PCR示意图 （引自Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Res.2005;33(20):e179.） 现在，成熟小RNA的表达测定亦可通过实时定量PCR进行（图2-3-5），其与前体小RNA的实时定量PCR检测最主要的区别在于它的反转录引物具有茎环结构并且含有一段共有序列，能高效结合于成熟小RNA3’末端进行反转录反应，从而定量检测成熟小RNA的表达。成熟小RNA商品化的检测试剂盒已被应用于研究中，如ABI公司的miVrna。 应用PCR方法既可检测小RNA前体又可检测成熟小RNA的表达，这对研究小RNA的表达调控具有重要的意义。研究者可以根据发育过程中不同阶段小RNA的表达差异准确观察存在于小RNA基因转录水平或其后两种RNA酶Ⅲ（Drosha和Dicer）作用过程的调控，从而帮助我们深入了解小RNA的起源和发生。由于实时定量PCR的高度灵敏性（可检测到总量低至纳克级的样品），Tang等使用该技术对单个人胚胎干细胞中220个小RNA的表达谱进行了考察。这种在单个细胞水平的检测方法的建立对于研究小RNA在那些数量有限的细胞群体（例如：原始生殖细胞等）中的作用有重要意义。 microRNA实时定量PCR操作步骤： （一） 总RNA提取 总RNA提取对于后续实验至关重要，高质量的RNA将确保小分子RNA不会丢失。目前，多个公司开发出RNA提取试剂