急性髓细胞性白血病细胞培养上清对CD4+ 和CD8+ T细胞增殖和凋亡的影响论文.docVIP

　　急性髓细胞性白血病细胞培养上清对CD4+ 和CD8+ T细胞增殖和凋亡的影响论文 .freelia Cell Supernatant on the Proli-feration and Apoptosis of CD4+ and CD8+ T Cell Subsets Abstract To study the effects of supernatant derived from acute myeloid leukemia (AML) cell lines on proliferation and apoptosis of CD4+ and CD8+ T cell subsets and to investigate the mechanism by immune recognition，lymphocytes ulated three AML cell lines (HL-60，NB4，U937). After culture，cell suspensions etry and their proliferation and apoptosis tilarly，the apoptosis of stimulated CD4+ T cells ulated CD8+ T cells remained unaffected by supernatant from HL-60 and NB4. In contrary，the apoptosis of proliferative CD8+ T cells AML cell lines inhibit the proliferation of CD4+ and CD8+ T cells and induce the apoptosis of proliferative CD8+ T cells，that may be one of the mechanisms by munity yeloid leukemia; CD4+T cell; CD8+ T cell; cell proliferation; apoptosis 急性髓细胞性白血病（AML）患者免疫功能的抑制是其发病率和死亡率增加的一个重要原因。研究显示，包括AML细胞在内的多种肿瘤细胞可通过分泌抑制性细胞因子影响T淋巴细胞的增殖和凋亡，进而发挥其免疫抑制功能［1-3］。但是，这些抑制性细胞因子对不同T细胞亚群功能的影响目前尚不清楚。CFSE是一种能自发不可逆地结合与细胞蛋白质上的活体荧光染料。当细胞分裂时，CFSE可平均分配到2个子代细胞中，其荧光强度将是亲代细胞的一半，并且能够利用流式细胞仪进行检测（F1通道）和分析。如同时标记不同的荧光抗体，则可实现对1个增殖细胞群内不同细胞亚群的增殖研究［4］。本研究采用上述方法观察白血病细胞培养上清对CD4+ 和CD8+ T细胞的增殖影响，同时利用7AAD检测不同T细胞亚群凋亡的变化情况，探讨AML免疫抑制的形成机制，以期为白血病的生物治疗提供可能的新思路。 材料和方法 细胞株及主要试剂 AML细胞株HL-60和NB4分别由附属协和医院血液病研究所吴青博士和李新刚博士惠赠，U937细胞株为本研究室所有。RPMI 1640培养液、胎牛血清购自Gibco公司，抗CD3抗体和抗CD28抗体购自R D公司，CFSE染料购自Molecular Probes 公司。藻红蛋白（PE）标记的CD4抗体和CD8抗体以及7AAD购自PharMingen公司。FACS Caliber流式细胞仪为美国Becton Dickison公司产品。 AML细胞株培养及上清收集 于37℃、 5% CO2孵箱中，以含10% FBS的RPMI 1640培养液培养AML细胞（HL-60、NB4和U937，浓度均为2×105），24小时后收集培养上清，滤去杂质，分别标记为HL-60-S、 NB4-S和U937-S，-20℃保存备用。 淋巴细胞悬液的制备及CFSE染色 抽取健康志愿者的外周静脉血，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMNC），用RPMI 1640重悬，于37℃、5% CO2孵箱中培养2小时，取出非贴壁细胞，用PBS洗涤，调整浓度为1×107/ml。CFSE用DMSO溶解成10 mmol/L的储存液，-20℃保存。临用前取适量用PBS稀释成5 μmol/L。加等量的CFSE稀释液入淋巴细胞悬液中，充分混匀，37℃下轻荡10分钟后，加等量的冰冷RPMI 1640（含10% FBS）中止反应，1分钟后用PBS洗涤2次，悬浮于含10% FBS的RPMI 1640 培养液中。 刺激淋巴细胞增殖 将AML细胞株培养上清和10% FBS的RPMI 1640培养液按不同体