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Biochemistry Experiments LOGO 蛋白质定量法 * Biochemistry Experiments * 一实验目的 掌握蛋白质定量法的分类、原理; 掌握紫外分光光度法和Folin—酚试剂法 掌握标准曲线绘制; 掌握分光光度计的使用; * Biochemistry Experiments * 二常用测定方法与原理 1. 凯氏微量定氮法 2. 紫外分光光度法 3. 双缩脲法 4. Folin—酚试剂法(Lowry法) 5. 考马氏亮蓝-G250 * Biochemistry Experiments * ?? 可见紫外分光光度法 (UV-vis Spectrophotometry) * Biochemistry Experiments * 分光光度法 根据物质的吸收光谱及光的 吸收定律，对物质进行定性、定量分析的一种方法。 * Biochemistry Experiments * ???? Lambert―Beer 定律: 当入射光强度一定时，溶液吸光度只与液层 厚度和 溶液浓度有关. * Biochemistry Experiments * 　分光光度计仪器型号很多，但其基本原理相似，其主要部件用方框图示意如下　光源 →单色光器 →吸收池 →检测器 →讯号处理 及显示器 分光光度计 * Biochemistry Experiments * 可见分光光度计是以可见光(钨灯)为光源，而紫外分光光度计是以氢灯作光源，经单色器分光后提供所需的波长进入被测溶液。 * Biochemistry Experiments * (一)紫外分光光度法 蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。 在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 优点:简单快速、不消耗样品、低浓度盐无干扰; 缺点:准确度差,受核酸影响。 * Biochemistry Experiments * 试剂 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 蛋白质标准溶液（1mg/ml） — 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 1.0(待测) 蒸馏水 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 3.0 蛋白质浓度 — 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 0.750 1.00 ？ 光密度值（记录） 0 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 * Biochemistry Experiments * (二) Folin—酚试剂法(Lowry法) Step 1 碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质－铜复合物 蛋白质－铜复合物使磷钨酸—磷钼酸还原 显色反应，蓝色。A650 在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。 Step 2 * Biochemistry Experiments * Folin—酚试剂法(Lowry法) 优点 缺点 操作简便灵敏度高 (25-250μg) 费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线不是严格的直线形式，专一性较差，干扰物质较多 可检测的最低蛋白质量达5 μ g/ml，通常测定范围是25~250 μg/ml * Biochemistry Experiments * 实验操作（取7支干净的大试管编号操作） 0 1 2 3 4 5 6 牛血清白蛋白溶液 — 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 — 待测样品 — — — — — — 1.0 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 — 试剂甲 5 5 5 5 5 5 5 混匀后室温10分钟 试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 立刻混匀,室温30min,0管调零,650nm比色 Pr含量(μg) ？ 吸光度(A) * Biochemistry Experiments * 标准曲线法 标准管对照法 Folin—酚试剂法(Lowry法) * Biochemistry Experiments * ???取标准品配成一系列已知浓度的标准溶液，在选定波长处(通常为λmax)，用同样厚度的吸收池分别测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标作图，得到一通过坐标原点的直线－标准曲线（工作曲线）。 标准曲线法定量 * Biochemistry Experiments * 理想标准曲线的特点 过原点的直线; A在0.05 ～ 1.0之间； mg 280nm A 0.125 0.25 0.375 0.5 0.625 * Biochemistry Experiments * 三实验操作注意事项 定量要求准确度高,吸量要保证