总蛋白提取试剂盒说明书.docVIP

总蛋白提取试剂盒 (Total Protein Extraction Kit) P1250：蛋白抽提试剂盒-I (实体组织和细胞蛋白抽提, 100 extractions) 从组织细胞中提取总蛋白是Western Blot的关键步骤。实体软组织如脑脊髓富含磷脂，神经血管含大量结缔组织，而脂肪则有大量油脂，常规的方法难以有效从这些组织提取蛋白。本试剂盒为组织或培养细胞总蛋白提取提供完整的解决方案。用裂解-结合缓冲液匀浆裂解实体组织，或直接用裂解-结合缓冲液重悬培养细胞，然后加入抽提试剂去除非蛋白成分，离心、干燥后即可得到总蛋白。蛋白沉淀溶解后用常规方法进行蛋白定量。提取过程可在30-60分钟内完成，可在1.5ml离心管微量提取也可大规模制备，极为简便高效。通常一次提取10-100mg组织所获得的总蛋白可进行几十到上百次分析如蛋白质电泳、Western Blot、免疫共沉淀。 组成 1. 裂解-结合缓冲液 100 ml 2. 抽提试剂 100 ml每毫升裂解缓冲液和抽提试剂可提取10-100mg组织或1 ( 107细胞。试剂盒的裂解缓冲液是过量的。适用 各种实体软组织( 1 mg)，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道组织、肾脏、 心脏、肌肉、血管、结缔组织等各种原代细胞和永生化细胞系保存：室温或4oC保存2年 固体组织蛋白提取每10-100mg固体组织剪碎后加入0.5-1 ml裂解液，放入玻璃匀浆器内上下手动匀浆15次；或用高速机械匀浆器12,000 rpm 破碎组织。注意：初始组织的量应在10-100mg范围。肝肾组织蛋白含量高，提取时应加较少量的组织，否则形成的蛋白膜厚、致密且难溶。少量小的未破碎组织不影响后续抽提。 仅取0.5ml组织匀浆液转移到1.5ml离心管，弃去剩余的组织匀浆液。每0.5ml组织匀浆液加入2倍体积的(1 ml)抽提试剂充分混匀。室温或4oC静置10分钟，偶尔晃动。注意：(1)如组织量10mg，在下一步离心时形成的蛋白膜易碎，静置30min有助蛋白膜形成。(2)提取脂肪组织时应4oC静置40min以上以充分去除油脂。(3) 0.5ml组织匀浆液获得的蛋白足以进行几十次Western Blot。保证每0.5ml组织匀浆液加入2倍体积的(1 ml)抽提试剂是成功的关键。 10,000g 4oC离心10分钟，溶液分为上下两相，两相中间为蛋白膜。吸除上层液体；随后用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜，吸除下层液体。蛋白膜将附着于离心管壁。注意：(1)离心速度过高将使蛋白膜过于坚固，难以溶解。(2)如果不能分相，可再加入50(l蒸馏水混匀离心。 (3)如果初始组织量较少(10mg)，离心后难以得到完整的蛋白膜，此时可吸去上下层液体，加入1ml纯乙醇混匀，10,000g 4oC离心3分钟。弃所有液体，蛋白沉淀在管底。 敞开管口，室温10分钟空气干燥沉淀。 每100mg组织所得到的蛋白加 200-1000(l用户自备的缓冲液，95oC煮10分钟。室温放置20~60分钟溶解沉淀。参见后面的说明。 培养细胞蛋白提取 参见固体组织蛋白提取程序中的注解 消化洗涤并800 g离心收集细胞。每5-10 x 106细胞加入0.5 ml裂解液，振荡重悬，4oC净置2分钟。 按比例每0.5 ml裂解液加入1 ml抽提试剂，振荡混匀。4oC静置10min。 10,000g 4oC离心10分钟，溶液分为两相，两相中间为蛋白膜。小心吸除上层相和大部分下层相，保留两相中间的蛋白絮状物。如果不能分相，可再加入50(l蒸馏水混匀离心。 加入1 ml纯乙醇洗涤沉淀。10,000g 4oC离心3分钟，蛋白沉淀在管底。 去除管中所有液体，敞开管口，室温空气干燥沉淀。 每1 x 106细胞可加入 50-200 (l (或适量)的蛋白溶解缓冲液，95oC煮5-10分钟，室温放置20-60 分钟溶解沉淀。离心除去不溶物。 说明 未溶解的蛋白沉淀不含盐、去垢剂、和还原剂成分。干燥蛋白沉淀可4oC或－20oC长期保存。 蛋白沉淀溶解步骤：(1)溶解于去离子水或用户自备的缓冲液，95oC煮10分钟。室温放置30~60分钟或4oC溶解5小时以上至过夜。12000rpm离心5 min去除任何不溶性沉淀。没有去垢剂时沉淀溶解缓慢且某些膜/疏水蛋白不能完全溶解。(2)有效的溶解推荐用此法，用2~5% SDS水溶液、或含5%SDS的自备缓冲液，或含2%SDS的标准SDS凝胶上样缓冲液，95oC 10分钟。沉淀量少会很快溶解。如沉淀很多或过分干燥，煮沸后4oC溶解5小时以上或过夜，可溶性蛋白应该溶解并释放到溶液中。4oC溶解过夜的不溶物主要是不溶性成分，通常不含对实验有用的可检测蛋白。12000rpm离心5 min去除任何不溶性沉淀。但对于绝大多数Western Blot