PCR技术级硕士—培训课件.ppt

目 录 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的类型和应用 PCR技术的创建 一、最初的理论描述—Khorana Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。” 但由于当时基因序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有实际意义。加上70年代初分子克隆技术的出现提供了一种克隆和扩增基因的途径，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…… PCR技术的创建 二、PCR技术的发明—Kary Mullis 1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼 1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上…… PCR从构想成为现实 1983年12月， Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片段； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人； 1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者； 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。 三、PCR技术的改进和发展 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术，大大提高了PCR的效率。 三、PCR技术的改进和发展 1988年第一台PCR仪问世，PCR逐步实现自动化 1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年。 1993年，Mullis因此项技术荣获诺贝尔化学奖。 PCR仪的变迁 三个水浴锅，用手移动 （Mullis等人当时用的） 电加热块 ＋ 自来水冷却 （PE，1988） 电加热块 ＋ 内置循环液冷却 （PE，1989） 三个加热块 ＋ 机械手 （Strategene，1994） 半导体制冷和加热（MJ, PE, BioMetra, Eppendorf） 空气加热 (Roche) 梯度PCR仪, 实时荧光定量PCR仪 Lab-on-chip式的PCR仪(芯片PCR) PCR技术的特点 灵敏度高 30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝） 将模板从皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个PFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 特异性强 引物序列与模板结合的特异性 快速简便 一次性加好反应液，2～4小时即可完成扩增 PCR的应用领域 生物学基础研究 目的基因扩增和鉴定；DNA序列测定；定点突变；基因表达分析 医学临床应用 遗传疾病基因诊断；致病病原体检测；癌基因检测；器官移植组织配型 法医学物证鉴定 个体识别；亲子鉴定 其他 动、植物检疫（转基因动植物检测）；生物物种鉴定，系统进化研究；分子考古学（恐龙DNA分析）等 PCR技术应用于临床检测 登革病毒的检测 小 结 参考书目 未 结 束 语 DMD：人类肌营养不良基因 A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8～19缺失 B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者 C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式 多重PCR检测DMD基因缺失 LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记,用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分 病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4 标记引物 ＰＣＲ 观察 PCR产物 锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） PCR的局限：需了解靶基因片段两侧的序列 对于未知序列怎么办？ cDNA 末端核酸转移酶 3’GG…GG 5’ CC…CC 锚定引物 3’GG…GG 5’ CC…CC 3’GG…GG CC…CC 锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增 PCR固相分析法 模板 生物素化引物 PCR扩增 探针 亲和固相介质 检测探针信号 可用于基因芯片的制作 原位ＰＣＲ 原位聚合酶链式反应（In St