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兽药残留前处理技术 Pre-treatment Technology of Veterinary Drug Residue  马勤川 威海德生技术检测有限公司 目录 contents 01 PART 概述  Introduction 浓缩 净化 提取 03 02 01 样品前处理是指样品的制备和对样品中的待测组分进行提取、净化和浓缩的过程。样品前处理的目的是消除基质干扰，保护仪器，提高检测方法的灵敏度、选择性、准确度、精密度。 基体复杂 各目标化合物 性质差异大 残留浓度低 检测限越 来越严格 01 02 03 04 SAMPLE TYPES 兽药残留分析中，最常用的生物样品是组织样品和禽蛋，其次是奶、血液和尿液样品。 肌肉中水分约占75%，蛋白质（肌浆蛋白、肌原蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白）占19%，脂肪（中性脂肪、脂肪酸和磷脂）占2.5%，糖类占1.2%，以及一些无机盐、维生素和酶类。肌浆蛋白（肌红蛋白、糖解酶）可溶于水，肌原蛋白（肌球蛋白、肌动蛋白）溶于浓盐水，胶原蛋白和弹性蛋白（结缔组织）在上述溶剂中均不溶。 禽蛋包括蛋黄和蛋清。蛋黄的含水量约50%、蛋白质16.5%、脂肪33%、糖类0.2%，以及一些无机盐、维生素和酶类（淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶、肽酶和过氧化氢酶）。蛋清含水量达88%，蛋白质10.5%和极少量的碳水化合物和脂肪。 与蛋清相比较，蛋黄基本上为疏水性环境，低极性药物的残留较多。如果需要分别测定蛋黄和蛋清中的残留，最好将刚产出后的蛋分离蛋黄和蛋清，避免药物由蛋黄向蛋清扩散。 奶中还含有大量由酪蛋白或脂蛋白构成的束胶体系，当酸化或加热时，束胶结构解体，蛋白质沉淀析出。非解离性的或极性较低的药物易由血浆向奶中扩散，导致奶中残留。与血浆样品类似，奶中的药物可与蛋白结合。 牛奶的含水量约87%，蛋白质（以酪蛋白为主）为3.3%，脂肪（甘油三酯）为3.7%，糖类（乳糖）为4.7%，以及一些无机盐、维生素和酶类（过氧化物酶、脂肪酶等）。 血液由血浆和血清组成。血浆和血清的化学成分与组织液相近，测定血浆或血清中药物浓度，比全血更能反映作用部分药浓的变化，测定方法一般也可互相通用。若血浆中含有抗凝剂对测定有影响，则应使用血清样品。通常药物在血浆中均与血浆蛋白（白蛋白、球蛋白、糖蛋白、脂蛋白）发生一定程度的结合，一些药物的蛋白结合率甚至可达90%以上。因此在萃取之前，必须将结合态的药物分离出来。 尿中药物大多呈结合状态，主要以葡萄苷酸和硫酸酯结合物存在，因此无论直接测定或萃取分离之前，都必须将结合态的药物水解，使药物游离处理。 尿液的主要成分是水、尿素及盐类。在所有体液样品中，尿样最容易获得，并且样品最多，内含药物（母体药物及代谢物）浓度高；正常尿液中仅含微量蛋白质，不需要去蛋白处理。 02 PART 样品预处理 Sample Pretreatment 常用的结合物水解的方法有酸水解和酶水解 药物在体内经第二相代谢反应之后，常形成葡萄糖苷酸、硫酸酯及磷酸酯等结合物。以结合状态存在的药物多存在于尿中，但也存在于肝脏、肌肉及血液中。 Lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipisicing elit 酸水解 有的药物的结合物则必须采取较剧烈的条件，如加入3 mol/L盐酸溶液后还必须煮沸1h，水解后的样品呈强酸性，必要时可用碱液调整pH后再进行萃取。 酸水解通常使用无机酸（盐酸），至于加入盐酸的浓度、酸化时间以及是否需要加热等，随药物性质而异，但最终应通过实验确定。 酶水解 β-葡糖苷酸酶可专门水解药物的葡萄糖醛酸苷，芳基硫酸酯酶和磷酸酯酶分别水解药物的硫酸酯和磷酸酯。也可用几种酶的混合物，将生物样品中药物的葡萄糖醛酸酐及硫酸酯同时水解。 酶水解是专属性很强的水解结合物的方法。通常使用的水解酶是β-葡糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶、磷酸酯酶等。 蛋白质 生物样品如肝脏、肾脏、血浆等含有大量的蛋白质，它们能结合药物，因此对于某些药物检测，必须先将与蛋白质结合的药物游离之后再作进一步处理。 除蛋白过程是将蛋白质变性处理后，把与蛋白质结合的药物解离出来，离心分离出去蛋白。通常除蛋白的方法是在含蛋白样品中加入适当的沉淀剂或变性剂，使蛋白质脱水而沉淀（如有机溶剂、中性盐），有的是由于和蛋白质形成不溶性盐而析出（如一些酸类：三氯乙酸、高氯酸、磷酸、苦味酸） 去蛋白原理 有机溶剂沉淀剂 甲醇与蛋白形成絮状沉淀易于离心分离，得到澄清的上清液；乙腈与蛋白形成致密沉淀，易离心除去，沉淀效率较甲醇高。使用时应加入足量的沉淀剂，通常加入量为样品体积的1.5～2倍。 酸沉淀剂 常用的酸性沉淀剂有三氯乙酸和高氯酸，其它还有钨酸、钼酸、磷钨酸、磷钼酸和苦味酸等。酸