代谢控制原理与方法—培训课件.pptVIP

控制生物素添加量使菌种生产Glu 高浓度bio增强羧化酶活性，促进羧化反应利于Glu合成。低浓度bio降低裂解酶活性，使菌体生长后关闭乙醛酸循环，使底物流向Glu合成，低浓度bio使膜磷脂合成缺陷，增加膜通透性，利于Glu胞外分泌，解除反馈调节，利于Glu合成并大量积累。 添加亚适量，5-10μg/L 培养基，生产Glu 培养前期，bio充足，存在乙醛酸循环，中间物质和能量充足，长细胞，膜磷脂合成正常，正常反馈调节，不积累Glu，细胞形态正常。 8hr Glu非积累型细胞 Glu积累型细胞 培养中后期，bio浓度渐低，乙醛酸途径减弱直至关闭，膜磷脂合成缺陷，膜透性增强，分泌Glu，解除反馈调节，大量积累Glu，细胞形态异常，未溶解。 第五节 Lys代谢控制发酵 生产菌种 谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum） 黄色短杆菌(B. flavum) 乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum) 2、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌Lys合成途径及正常调控机制 Asp 天冬氨酸 Asp 激酶 天冬氨酸-P 天冬氨酸-β –半醛 高丝氨酸 二氢吡啶-2,6-二羧酸 O-琥珀酰-高丝氨酸 蛋氨酸(Met) 高丝氨酸-P 苏氨酸（Thr） 异亮氨酸（Ile） Thr脱氢酶 赖氨酸(Lys) Hse脱氢酶 DDP合成酶 合成酶 Asp三分支途径优先合成Met，后合成Thr、Ile，最后合成Lys Thr和Lys对Asp激酶有协同反馈抑制 Thr对Hse脱氢酶有反馈抑制 Ile对Thr脱氢酶有反馈抑制 Met对O-琥珀酰高丝氨酸合成酶有反馈阻遏 3. Lys 代谢控制发酵 菌种的遗传改造 (1)切断支路代谢——Hse营养缺陷型(Hse-)菌株筛选 选育Hse脱氢酶缺失的Hse-菌株，使代谢流向Lys合成，控制Hse添加量，既满足菌体对Met、Thr和Ile生长需要又不形Thr和Lys对Asp激酶的协同反馈抑制，积累Lys (2)用Hse-菌株选育解除Lys反馈抑制突变株 Hse- 诱变 Hse-Lys反馈抑制 Hse-抗Lys反馈抑制 长出菌落 (Hse-, AECr) 基本培养基＋Hse(高浓度)＋AEC(Lys结构类似物) Hse-, AECr：解除Lys对Asp激酶反馈抑制的Hse营养缺陷型双突变株，不论添加Hse浓度高低，皆不会出现Thr+Lys协同反馈抑制，大量积累Lys (3) Hse脱氢酶渗漏缺陷型突变株 日本椎尾等人 黄色短杆菌 突变株 亚硝基胍 Hse脱氢酶活性仅为 野生型菌株的1/30 Met，Thr合成量很少，仅满足菌体生长 代谢流转向Lys大量合成 Thr合成量少，和Lys形不成协同反馈抑制，大量积累Lys，产量达25g/L (4) Lys 生产菌种遗传标记及Lys产量 谷氨酸棒杆菌 Hse－ K.Nakyama 13g/L Hse－AECR 中山清（日本） 42g/L 黄色短杆菌 Hse－AECRCSIFps I.shiio 51g/L (CSI:柠檬酸合成酶抑制；Fps：氟代丙酮酸敏感) 黄色短杆菌 AIII Hse-AECr 徐所维 50-55g/L 钝齿棒杆菌 pI-3-2 Hse-AECr 陈琦 50g/L (5) 乳糖发酵短杆菌Lys代谢控制发酵 Lys合成与调控机制基本同于谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌。 特殊调控：代谢互锁调控机制 互锁调节：Lys合成受其它氨基酸合成途径产物反馈调节 Lys生产菌种遗传标记和产量： Hse－AECRLeu－ 110g/L （加Hse，限量加Leu，免除Leu对DDP合成酶反馈阻遏互锁调节） Hse－AECRLeu－α-TARAla－ 110g/L （加Hse、Leu，限量加Ala，α-TA是Leu结构类似物） Asp Asp激酶 Asp-P Asp-β –半醛 Hse Met Thr Lys Ile DDP 协同反馈抑制 DDP还原酶 DDP合成酶 反馈抑制