反相HPLC法测定大鼠组织中异钩藤碱含量论文.docVIP

　　反相HPLC法测定大鼠组织中异钩藤碱含量论文 .freelm×250 mm,5 μm)为固定相,前置保护柱为ethod The tissue sample ethanol,.freelethanol, then detected by RP-HPLC directly. m×250 mm, 5 μm) and pre-column m×10 mm, 5 μm) ine obile phase L/min. The . Results The standard curve of Isorhynchophylline concentraton in rat tissues：Y＝48.558X＋0.207 6 (n＝6), r＝0.999 6, it appears a good linear relationship L. The average recovery of ehod is sensitive, rapid, simple, specific and reproducible. Key ination；HPLC 异钩藤碱(Isorhynchophylline,Isorhy)系中药钩藤的主要生物碱之一,具有降低血压及明显负性变时等效应,与扩血管药配伍使用时,可增强降压作用,同时可克服扩血管药加快心率的不良反应1-2。本试验采用反相HPLC法测定大鼠组织中异钩藤碱的含量,为后期研究异钩藤碱在大鼠组织内的分布,继而对钩藤的归经理论研究奠定基础。 1 仪器与试药 日本岛津LC-20A高效液相色谱仪,包括LC-20AD 高压泵工作站,SPD-20A紫外检测器,浙江大学N2000色谱数据处理机,恒温箱。异钩藤碱对照品购于南昌贝塔生物科技有限公司,批号10525-080117,纯度98%以上。钩藤购于成都市新荷花饮片公司,经西南交通大学生命科学与工程学院药学系宋良科教授鉴定为2005年版《中华人民共和国药典》(一部)规定入药的钩藤。内标物卡马西平购自中国药品生物制品检定所,批号100141- 199503。甲醇为色谱纯,三乙胺等其他试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱为m×250 mm,5 μm),前置保护柱为m×10 mm,5 μm)。流动相：甲醇-水(70∶30)含0.03%的三乙胺,流速：0.8 mL/min,检测波长：λ＝254 nm。 2.2 对照品和内标储备溶液的配制 精密称取异钩藤碱2.0 mg、内标卡马西平2.5 mg,分别置于10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度线,得到浓度为200 μg/mL的异钩藤碱对照品储备液和浓度为250 μg/mL的卡马西平内标储备液。 2.3 样品制备 L),剂量为含原药材1.25 g/kg,连续灌胃3 d,第3日灌胃2 h后断头处死,取其肝、肾组织,生理盐水洗净,3层滤纸吸干,称取一定量用生理盐水制成L,置于2 mL的干燥离心管中,加入100 μL的内标储备液,加2 mL甲醇,涡旋混匀30 s,静置沉淀2 h,取出,3 500 r/min离心7 min,取上清液于干燥的离心管中,氮气流吹干,甲醇500 μL复溶2 h,10 000 r/min离心5 min,取上清液20 μL进样检测。 2.4 专属性试验 按照“2.3”项下方法制备空白组织溶液、含异钩藤碱的供试品溶液。分别精密吸取空白组织溶液、含异钩藤碱的供试品溶液、对照品溶液20 μL进样并测定,色谱图见图1。结果表明,阴性样品色谱图中对照品峰相应保留时间处未见色谱峰。 2.5 线性关系考察 于空白组织匀浆中加入不同量的异钩藤碱对照品储备液(200 μg/mL的甲醇液),配成系列浓度0.16、0.8、1.6、4.0、8.0、16 μg/mL,按照“2.3”项下方法进行处理后,分别取20 μL进样测定。以组分与内标的信号比对组分浓度做标准曲线,求得回归方程为：Y＝48.558X＋0.207 6(n＝6),r＝0.999 6(X为异钩藤碱峰面积与内标峰面积之比,Y为异钩藤碱浓度),在0.16～16.0 μg/mL范围内线性关系良好。 2.6 大鼠组织中异钩藤碱含量的测定(见表1、表2) 表1 肝组织中异钩藤碱的含量，表2 肾组织中异钩藤碱的含量（略） 2.7 精密度试验(见表3) 准确配制浓度为0.16、1.6、16 μg/mL异钩藤碱组织匀浆液各3管,1日内经上述组织样品处理方法处理后进行测定,计算日内精密度。不同日内测定,求得日间精密度。表3 精密度试验结果(略) 2.8 加样回收率试验(见表4) 取已测异钩藤碱含量的组织样品9份,分3组,每份0.5 mL,分别加入异钩藤碱对照品储备液(浓度为200 μg/mL)1、5、25 μ