第三章蛋白质一级结构的测定.ppt

蛋白质一级结构测定的意义 ①是推测蛋白质高级结构的分子依据 ②是理解蛋白质功能的分子基础 ③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段 ④是研究生物进化的分子佐证 二十种常见蛋白质氨基酸结构的分类 非极性R基团氨基酸 不带电荷极性R基团氨基酸 带电荷R基团氨基酸 中性脂肪族氨基酸 酸性氨基酸及酰胺 碱性氨基酸 杂环氨基酸 芳香族氨基酸 (一) 蛋白质的水解： 1、酸水解 常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水解，反应时间24?72h，水解后除去盐酸。其中盐酸水解是目前水解蛋白质或多肽最广泛的一种方法。 此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化，得到的是L-氨基酸。缺点是Trp被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如Ser、Thr、Tyr有一小部分被分解；Asn、Gln侧链的酰胺基被水解成了羧基。 甲基磺酸具有许多优点，目前，常用它代替盐酸来水解。 2、碱水解 一般用5mol/L氢氧化钠煮沸20h左右。 由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。 部分的水解产物发生消旋化，其产物是D-型和L-型氨基酸的混合物。 该法的优点是色氨酸(Trp)在水解中不受破坏。 3、酶水解 目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。 应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。受酸水解影响较大的氨基酸(如Trp、Asn、Gln)等，都可用酶水解。缺点是不易达到彻底水解，影响氨基酸的回收率。 最常见的蛋白水解酶有以下几种：链霉蛋白酶、Leu氨肽酶（水解产物为较小的肽段和氨基酸）、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶。 当前使用最普遍、最有效的是以离子交换层析为基础研制的氨基酸自动分析仪。 Spaekman等发展起来。 使用的材料是磺酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂，在pH2.0的条件下，全部氨基酸都能结合在树脂上，提高pH和离子强度，可将氨基酸依次洗脱下来，从而达到分离的目的。 洗下的大多数氨基酸与茚三酮反应产生蓝紫色，570nm有最大吸收，而脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色，于440nm比色测定。 目前最好的仪器样品分析量只要几十Picomole,分析时间只要20分钟左右，而且计算全部自动化，给研究蛋白质一级结构带来了极大的方便。 高效液相色谱（HPLC） （三）特殊氨基酸的测定： 1.Trp的测定： 酸水解时易破坏，可以在酸水解液中加入2-4%的巯基乙酸来提高Trp的收率（90%），或直接改用碱水解，再用标准氨基酸柱层析法进行分析。 (1) 紫外吸收法： 将蛋白质样品溶于6mol/L的盐酸胍溶液中，然后测定蛋白质溶液在280nm和288nm的光吸收。根据下面的公式来计算Trp的残基数： (2)对-二甲基氨基苯甲醛法： Trp在强酸下与醛反应生成有色产物，其颜色深浅与Trp含量呈正比，在590nm有最大光吸收。 Ellman法：前提是有游离的-SH存在， Ellman试剂与二硫键发生反应。(如果蛋白质中没有活泼的巯基，可加入巯基化合物，如cys、谷胱甘肽和二硫苏糖醇，以便启动这个反应。) 1、自由氨基酸重量/蛋白质重量X100% 2、氨基酸分子数（氨基酸残基数）/蛋白质分子数 3、氨基酸残基重量/蛋白质重量X100% 4、氨基酸含N摩尔数/蛋白质含N摩尔数(含N百分率) 例子： 已知胰岛素分子量为5734，Asp的分子量133.11，将1720?g胰岛素纯品彻底水解，得到Asp0.91?mol,Ser0.87 ?mol, Lys0.31 ?mol,Arg0.3?mol.请用不同的方式表示胰岛素中氨基酸的组成。 1、自由氨基酸重量/蛋白质重量X100% 自由Asp的重量=133.11?0.91=121.1 ?g，所以自由Asp的百分率= 121.1 / 1720=7.06% 2、氨基酸分子数（氨基酸残基数）/蛋白质分子数 胰岛素分子数= 1720 ?g?5734=0.3 ?mol，所以，胰岛素中Asp残基数= 0.91?mol ? 0.3 ?mol=3.03个，即3个。 3、氨基酸残基重量/蛋白质重量X100% Asp残基百分率= （133.11-18）?0.91/ 1720=6.15% 4 、氨基酸含N摩尔数/蛋白质含N摩尔数 Asp含N摩尔数=0.91 ? 1 ?mol，胰岛素含N摩尔数=0.91 ? 1+0.31 ? 2+0.3 ? 4+0.87 ? 1….=19.53 ?mol 所以Asp含N百分率= 0.91 ? 1 / 19.53 =4.66% (五)蛋白质营养价值的评价 必需氨基酸：人和非反刍动物体内不能合成，必须