荧光光谱FL.ppt

分子发光光谱法Molecular Luminesence Spectrumetry 主要和常用的荧光磷光分光光度计及型号 2. 分子的活化与去活化 分子的活化与去活化 (p78) 三. 金属螯合物的荧光 四. 荧光的猝灭  紫外-可见分光光度计测量池(吸收池) Scatchard 金属配合物的Scarchard Plot 荧光分光光度计 样品池 I0 It I0 It IF,p 六. 磷光分光光度计 1. 光学系统与荧光分光光度计的区别 光源 样品池 激发 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 发射 单色器 切光器（斩波器） 共振荧光：10-12 sec 荧 光：10-8 sec 磷 光：1~10-4 sec 迟滞荧光：100~10-4 sec 2. 样品池与荧光分光光度计的区别 通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。 §４ 荧光分析法的应用 一. 工作曲线法 荧光分析的灵敏度比紫外－可见分光光度法高103～104. 荧光熄灭工作曲线法 Fx F Cs Cx 直接荧光标准曲线法 F Cs Fx Cx 二. 荧光分析法的灵敏度 注意：低浓度时成线性关系；高浓度时由于自猝灭、自吸收等原因不成线性关系。 在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的螯合物。 三. 荧光分析的应用 1. 无机化合物 直接荧光测定法 其中，较常测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到10-10; 某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。 较常测定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W 荧光熄灭测定法 自从1867年Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定以来，采用有机试剂可以测定70多种元素。 催化荧光测定法 较常测定的元素有：Cr、Nb、U、Te、Pb 某些元素虽然与有机试剂形成发荧光的配合物，但是反应速度慢，在某些微量元素的催化下，反应速度会加快，在特定的时间内可用来测定微量元素。 低温荧光测定法 常测定的元素有：Cu、Be、Fe、Co、Os、Ag、Au、Zn、Al、Ti、V、Mn、Er、H2O2、CN 某些微量元素存在，会催化发荧光的配合物产生荧光熄灭，在特定的时间内可用来测定微量元素。 溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮 －1960C 较常测定的元素有：Ce、Sm、Tb 等稀土元素 　　　　　　　　　Sb、V、Pb、Bi、Nb、Mn 固体荧光测定法 固体荧光发在荧光分析中也经常用到。 芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型。 ２. 有机化合物 0.001~0.033 470 395 3-乙酰氧基吲哚 玻璃酸梅 0.05~5 470 365 邻苯二醛 胍基丁胺 0.0625~0.625 500 420 α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨乙基)-氨基氮杂蒽 青霉素 0.01~50 425 315 氧化酶 氨基酸 1.5~15 505 465 蒽酮 糠　醛 0.06~6 540 紫外 曙红丫 蛋白质 10-4 485 365 苯二胺 四氧嘧啶 0.001~0.02 525 420 乙二胺 肾上腺素 0~20 490 345 无水乙醇 维生素A 0.1~2 蓝色 紫外 苯胺 丙三醇 测定范围 ppm λemmax λ exmax 试剂 待测物 3. 生命与生物物质 （如：DNA相互作用， VB的测定等） 小分子与DNA相互作用研究 D. Watson H. Crick 应 用 激发波长525nm，发射波长500－700nm的荧光图谱 * * 仪 器 分 析 Instrumental Analysis 分子荧光: Fluorescence; 分子磷光:Phosphorescence HITACHI（日立）F-4500 荧光分光光度计 荧光/磷光/发光分光光度计(PerkinElmer) LS-55 § 1 分子发光的基本原理 第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”