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细胞分子模型 第1节 概述 细胞分子模型与动物模型的区别： 动物模型 优点： 传统的筛选方法 直接反映治疗效果、不良反应、毒性作用 预测临床价值、应用前景 不足： 筛选效率低，并非均有疾病模型，动物个体差异，成本高 细胞、分子水平药物筛选模型 优点： 耗材少 药物作用机制明确 筛选规模大，高通量筛选 已成为药物筛选的主要方法 快速、微量、大规模为特征的高通量筛选 分子水平的药物筛选模型： 　受体、酶、通道、基因、其他 标准的体外分子水平筛选 优点： 快速 微量 筛选结果准确、稳定，易于评价 不足： 只能对特定靶点的单指标检测 提供化合物对靶点作用的有限信息，无法对化合物的生物活性进行综合评价 单纯的分子水平的高通量药物筛选技术已不能满足新药发现的需要 受体筛选模型 受体与放射性配体结合模型：将受体、配体、被测物及必要的辅助因子一起加入到缓冲溶液中温孵 达到平衡后过滤, 滤纸上残留的即为结合的放射性配体,通过液体闪烁计数来测量 灵敏度高、特异性强 适合大规模筛选 酶筛选模型: 筛选作用于酶的药物 主要观察药物对酶活性的影响 酶的反应底物和产物皆可作为检测指标,由此确定反应速度 第２节　细胞水平药物筛选模型 细胞水平药物筛选模型：以细胞功能为基础的筛选模型 (1) 完整细胞，活细胞自然条件下研究药物对生命体功能的影响，接近体内的生化过程，比较准确地了解药物的生物学特性，提供生物相关信息，一次试验可获得多个参数的高内涵信息 (2) 着眼于细胞整体的某些功能和信号转导途径中的其他位点 在对每一个分子通路并不完全了解的情况下, 细胞水平筛选是唯一可用的方法 (3) 鉴定分子水平发现的化合物 (4) 观察被筛选样品对细胞的作用, 不反映药物作用的具体途径和靶标, 只反映药物对细胞生长过程的综合作用 (5)细胞模型的材料来源较容易 用于药物筛选的细胞：正常细胞、转基因和病理细胞等 多数生物性物质均可通过转基因的方法由细胞表达 (6)分子生物学和细胞生物学手段 特别是基因芯片技术 发现疾病有关基因,克隆 建立稳定细胞株 大规模药物筛选 目前： (1) 微量化，超高通量化 1 536孔板，荧光方法可达3 456－9 600孔 微量化技术是实行超高通量筛选( uHTS)的基础 载体微孔板硬度、自动化加样精度 检测系统 数据分析系统 (2) 均质检测：一步加入 (3) 多指标、多靶点、多通道检测是现今细胞水平高通量筛选技术的核心和关键 光显微荧光成像技术是进行多指标检测的基础 多指标、多靶点检测有助于发现药物作用的新途径，深入认识药物作用的机制 为筛选具有互补的多靶点作用机制的单一治疗药物提供了手段和工具 (4) 实时动态检测和可视化 对活细胞进行荧光标记，荧光成像技术， 分子水平的实时动态检测和可视化研究 自动图像分析和数据量化分析 第３节 常用技术 1 细胞水平重组技术 重组技术是细胞水平高通量常用技术手段 经典方法是通过重组基因在宿主细胞基因组的随机整合而产生稳定细胞株 不足：重组基因的定位不可预测，表达水平受重组位点的影响，基因拷贝数不确定，阳性克隆的产生率低，筛选时间长等 现用游离体载体( episomal vector)：转染效率高，阳性克隆筛选速度快 2 报告基因技术 将靶基因连接到细胞上，通过激活或抑制靶基因导致报告基因的表达，通过比色、荧光或发光的方法检测 简便，如荧光素酶( luciferase)和β-半乳糖苷酶报告基因系统，不需裂解分离可直接均质检测 用于活体细胞的报告基因多是绿色荧光蛋白(GFP)，适于活体细胞检测，被称为生物传感蛋白 优点： GFP自发荧光，且荧光稳定；不需其他的底物和辅因子；GFP与其他蛋白嵌合后不影响其自身荧光特性 GFP及其变体：用于实时动态研究体内或细胞水平的蛋白定位和转位，蛋白的降解，蛋白-蛋白的相互作用，细胞骨架动力学，细胞周期，检测目的基因表达变化 β-内酰胺酶，水解荧光能量共振转移( FRET)底物CCF4 /AM行定量检测，或作为核因子调节的指示蛋白，用于受体功能筛选 3 荧光检测分析技术 定量读取荧光密度；单次实验中同时获得其他荧光特性，如荧光寿命、极化、淬灭，提高筛选的有效性，可快速、多参数地评价样品和靶之间的相互作用 (1)极化荧光( fluorescence polarization, FP) 　分析生物体系中分子间相互作用，根据荧光标记的小分子在游离和与大分子结合靶标2种状态时的极化荧光值不同而区分 优点： 不用分离荧光标记物，反应在均相溶液中进行 检测时间不会影响结果 高灵敏性、高稳定性、可重复性 操作简便，假阴性或假阳性率低 用于细胞水平的膜受体如GPCR、核受体调节剂的HTS筛选，如促肾上腺皮质激素2α亚型受体(CRF2αR)的功