凝胶过滤层析法教学专用.pptVIP

葡聚糖凝胶(G) 上样量对层析结果有直接的关系，上柱体积比上柱浓度的影响更大。 在凝胶过滤层析中，流速是重要的参数，流速与层析的分辨率有直接的关系 I、层析柱：2.6cm×85cm,流速2ml/cm2×h-1 II、层析柱：2.6cm×85cm,流速25.5ml/cm2×h-1 III、层析柱：2.6cm×19.5cm,流速24.5ml/cm2×h-1 在凝胶过滤层析中，样品的粘度也是一个需要考虑的因素。一个粘度很大的样品上柱后，样品分子因运动受限制，进出凝胶的孔隙不易，因此峰形显得宽而矮，有些可以分离的组分也会因此而重迭。结果如图： 血红蛋白在凝胶过滤柱上的分离图谱，层析柱： 4cm×85cm,Sephadex G-25;流速：180ml/cm2×h-1 未加葡聚糖2000，粘度：1.0厘泊 血红蛋白在凝胶过滤柱上的分离图谱，层析柱： 4cm×85cm,Sephadex G-25;流速：180ml/cm2×h-1 加2.5%葡聚糖2000，粘度：4.2厘泊 血红蛋白在凝胶过滤柱上的分离图谱，层析柱： 4cm×85cm,Sephadex G-25;流速：180ml/cm2×h-1 加5.0%葡聚糖2000，粘度：11.8厘泊 在特殊情况下，为使层析形成很好的界而，希望样品的比重大一些，可用向样品中加入蔗糖的办法实现。如加蔗糖的量不太大时，可取得很好的效果，但一般要将粘度控制在5厘泊以内。如粘度太大时效果可能适得其反。 洗脱：凝胶过滤的洗脱比较简单，除极个别特殊情况外都用单一的缓冲液。与一般交换树脂洗脱不同，洗脱液加在柱上的压力与流速之间没有直线关系。尤其是交联度小的凝胶，当压力差大时流速反而降低。压力与流速的关系如图： V= K×ΔP L 柱体积：2cm×65cm：凝胶Sephadex G－25(50~80目)； 样品：尿甘酸 100ml/h 凝胶过滤的应用 1、脱盐和浓缩 2、生命物质的分离 3、分子量的测定：测定大分子的分子量是凝胶过滤的应用之一。将已知分子质量的标准物质，在同一凝胶柱上以相同条件进行过滤层析，由于加入凝胶柱的物质分子质量不同，洗脱体积也不同。可根据洗脱体积求出柱的分配常数Kav，而Kav与蛋白质分子质量之间又存在线性关系，利用这一关系可绘制出Kav与分子质量的标准曲线。 方法的局限性： 1、在pH6～8的范围内，直线关系比较好，在极端pH时因蛋白质变性而引起偏离； 2、分子量与分配系数Kav有关，当蛋白质的轴比较大时，会引起测定偏离； 3、糖蛋白的含糖量大于5％时，测得的分子量比真实分子量大。 logM=a-b Ve V Superdex(BioPrecess介质)素列产品性能 (六)、聚乙烯醇系(Toyopearl)：以交联聚乙烯醇为骨架的凝胶过滤介质，20世纪80年代初部世，由美国RH公司与日本曹达公司联合开发。是多孔的三维网状结构，大分子链上含有丰富的羟基，使其具有高度亲水性，进行化学改性后可转变为含有多种功能基的离子交换剂及亲和吸附剂。Fractogel TSK是该系列的类似产品，适用于HPLC(高效液相层析)。 Toyopearl系型号及性能 二、分子筛原理 凝胶层析中常用的术语和参数 床体积：膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（Vt）表示。 Vt=V0+Vi+Vg 内水体积：是层析基质颗粒内部所含水的体积，用（V0）表示。 外水体积：层析基质颗粒之间所含水的体积，用（Vi）表示。 基质体积：层析基质本身在层析柱中所占有的体积（Vg）表示。 膨胀度：在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积，用Vg表示。即每克溶胀所具有的床体积。 分配系数：指一组分在固定相与流动相中含量的比值。 凝胶过滤的分配常数 Kav= Vt-Vo Ve-Vo 在给定的条件下，Vt和Vo都为恒定值，而Ve随着分离物分子质量的变化而变化。对凝胶过滤，其分配常数应在0≥Kav≥1。当被分离物质完全排阻时，Kav等于0，Ve等于V0；当被分离物质自由扩散时，Kav等于1，Ve等于Vo＋Vi。 从上式可以看出，Ve、Vo可通过层析过程中测定，只要测出Vt即可计算出Kav。 Vt是凝胶过滤柱床总体积，由三部分组成，即Vo＋Vi＋Vg。 Vt＝πr2h 或用 Vt＝Vo＋Vi＋Vg Vg很小，可忽略不计。V0一般用蓝色葡聚糖2000测定，其分子是为200万，呈蓝色，在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可直接观察。 Vi的测定：选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出洗脱体积，减去V0就是Vi。常用铬酸钾来测定，铬酸钾为黄色化合物，可直接观察，优点为不与葡聚糖起任何反应；也可用硫酸铵测定，用硝酸银检出洗脱峰。