哺乳动物基因工程—培训课件.ppt

3）脂质体法（liposome） 应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构——脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。 DNA 细胞融合 转化细胞 PEG 　仙苔病毒 DNA 脂膜 4）同源重组法 同源重组（homologus recombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。 是将外源基因定位导入细胞的染色体上。  单交换 双交换 通过同源重组定点插入珠蛋白基因 Xba I BstXI Xba I δ β △β neo XbaI BstXI δ Δβ β neo 正常基因座位 带有珠蛋白基因的质粒 C 重组后，插入外源基因片段带有——neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo 的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。 5）病毒介导基因内转移（Viral mediated transfer） 是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞 感染细胞 重组病毒 逆转录病毒(RNA) 常用的病毒载体 DNA病毒 1) 逆转录病毒（retrovirus） 目前应用最多、最成功. 病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。 例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构： LTR LTR ψ gag pol env U3 R U5 U3 R U5 U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点。 Ψ=病毒包装信号， gag =核心抗原， pol=逆转录酶， env=外壳蛋白。 逆转录病毒载体优点： ①高效感染宿主细胞，转染率可达100% ②病毒基因和所载的外源基因都可能表达 ③宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留 缺 点 ①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段； ②病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的 外源基因可能不适当的表达； ③逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。 根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包装信号。 6）受体载体转移法 将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。 重组质粒 配体 细胞膜 复合物 三）靶细胞的选择 靶细胞是指接受外源Gene的体细胞 选择靶细胞的原则是： 1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术 操作； 2）易于由人体分离又便于输回体内 3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至 几年，或整个生命周期） 4）易于受外源遗传物质转化。 常见的靶细胞 外周血T淋巴细胞 上皮细胞 内皮 皮肤成纤维细胞 造血干细胞——β地中海贫血、严重 复合免疫缺陷病等基因治疗 肝C——家族性高胆固醇血症、低密度 脂蛋白病的基因治疗 肌细胞 三、Gene治疗的现状与前景 体细胞Gene治疗临床实验已经开始，生殖细胞Gene治疗正在完善。进行基因治疗必须具备下列条件： 具备下列条件 选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，Gene的结构和功能。 被纠正的基因已克隆，并清楚Gene表达与调控机制与条件。 选择适当的受体细胞并在体外有效表达。 安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。 基因治疗实例 1、复合免疫缺陷综合征的基因治疗 （人类Gene治疗成功例子） ADA缺乏症-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。 ADA-Gene