第五章固定化酶和固定化细胞下新.pptVIP

Enzyme Engineering酶工程 第五章 固定化酶 第三节 微生物、植物和动物细胞固定化 细胞特性比较 固定化细胞的特点 类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞 生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器） 活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞） 形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。 最多使用：颗粒状珠体 使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性，只要载体不解体，不污染就可以长期使用。 概念： 固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。 细胞固定化方法 吸附法 包埋法 酶和细胞固定化示意图 吸附法 主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。 包埋固定法 在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。 包埋法分类 常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺 常用凝胶包埋法 举例：海藻酸钙包埋法 基本操作是：称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中（常用CaCl2 溶液），形成球状固定化细胞。 通过改变载体溶液参数包埋细胞 改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态，将细胞包埋其中。 研究热点——光交联树脂包埋法 例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得。 固定化死细胞（热处理）： 对于耐热性较好的酶，分离得到菌体后，经过一定温度热处理后，使菌体内的自溶酶系失活，细胞结构固化，目的酶被固定的细胞内。 此法比较简单，不需要载体，也无需分离制取酶。 耐热性酶：耐热性脂肪酶 第四节 固定化原生质体和辅酶 一 、原生质体的制备 二、 固定化 三 、举例 四 、辅酶固定化 一 、原生质体的制备 将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中——加入水解酶——分离——得到 二 、原生质体固定化的方法 将原生质替制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。 三 、辅酶固定化 1 原因 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应 有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵 ——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生 辅酶固定化的方法： 2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。 3 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。 辅酶的固定化 辅酶的固定化 辅酶固定化的形式： 第五节 固定化酶的性质 及其影响因素 一、 影响固定化酶性质的因素 二、 固定化后酶性质的变化 三、 评价固定化酶的指标 一、 影响固定化酶性质的因素 1． 酶本身的变化 分子构像的变化： 主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。 一、 影响固定化酶性质的因素 2． 载体的影响 （1）位阻效应 （2）微扰效应 （3）分配效应 （4）扩散限制效应 3. 固定化方法的影响 二、固定化后酶性质的变化 1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降 原因：酶结构的变化 载体与酶活性中心重要氨基酸 酶与底物空间位阻 2 、固定化后酶稳定性提高的原因： a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。 pH对酶活性的影响： （1） 改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。 pH对固定化酶的影响 1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。载体带正电荷，pH向酸性方向移动。