生物显微镜技术6-显微操作技2.pptVIP

第六章 显微操作技术 显微操作技术(micromanipulation technique)是在20世纪60年代后期随着细胞学实验、细胞核移植技术和医学界显微外科技术的开展而发展起来的。 显微操作技术具体是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器(micromanipulator)进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植、显微切割、细胞膜打孔、外源基因显微注射导入等，是现代生物学重要的实验技能之一。 第一节 显微操作仪 显微操作仪目前使用较为广泛的有两类： 一类为球面、齿轮机械传动操作式，如德国Leica公司生产的MicromanipulatorM； 一类为液压传动操作式，如日本Narishige公司生产的MO-IM系列。 显微操作仪的基本部件包括显微镜和显微操作器，附件配备有显微锻造器、拉针仪、吸管研磨器、微型注射器等。 常用于显微操作观察的显微镜有倒置显微镜、落射光或透射光显微镜及荧光显微镜等，其要求视场、工作距离大，最好配备有显微摄影装置或显微摄像装置，以便记录和分析。 1、显微操纵器主机 主要有机械传动操纵式和液压传动操纵式两种。机械传动操纵式以Leitz公司生产的MicromanipulatorM为例。液压传动操纵式以Narishige公司生产的MO-IM为例。 2、针具套管 Leica公司生产的针具套管包括针具、紧固螺帽、引导圈、丝管和套管。 液压传动显微操纵器的针具套管及套管夹持固定装置与机械传动显微操纵器基本相同，但主要操作有所不同，它是通过液压传动装置而非机械球面微动传动。液压传动具有更稳定、操作简便及针具运作更安全的特点。 针具、紧固螺帽、引导圈、丝管、套管 3、机械传动操作仪的操作步骤 (1)将显微镜及显微操作仪置于无震动的坚固实验台上，此时应注意避湿、避水和避免阳光直射。 (2)调整显微操作仪的倾斜标尺为“0”；调整显微操作仪，使其上罩盖和显微镜的载物台保持水平。 (3)调整针具套管上的针具进入显微镜视场中央，并使横轴粗调节轮左右、纵轴粗调节轮前后具有一定的调节动作范围，同时保持操纵杆和精细旋转调节柄相对垂直，以便获得适中的操作范围。通常垂直调节在28mm内，水平调节横轴粗调节轮在横向16mm内，纵轴粗调节轮在纵向40mm内，水平调节精细旋转调节在0.1-4mm之间可变，操纵杆总旋转度40°，倾斜调节在15°可调。 (4)针具进入视场中央后，进一步进行显微镜的进光和焦距等的调整，同时调整显微操作仪上各调节螺栓，使针具在显微镜的视场内能在前后、左右、上下及倾斜操作动作上均保持有合适的操纵范围。 (5)为了针具的安全操作，特别需要注意显微操作仪的横轴粗调节轮、纵轴粗调节轮上旋转调节柄的运作幅度及倾斜范围，通过操纵杆动静螺圈和幅度调节圈进行幅度控制及松紧调整，以获得满意的效果。 (6)操作完毕，针具退出视场，关闭光源，擦拭清洁显微镜及显微操作仪器，并给予保养，盖好防尘布罩。 4、显微操作仪附件设备 显微操作仪附件设备主要有显微针具锻造器、磨针器、拉针器、显微注射器及毛细玻璃管针具等。 烧针器 主要是用来加热锻造玻璃管针具 拉针器 磨针器 研磨器主要是通过机械研磨将玻璃针尖加工成各种斜角、粗细角、钝锐角等 专用硬质毛细玻璃管(如硼硅酸盐玻璃毛细管)外径lmm，可以向专业厂商购置。利用针具锻造器、拉针器和研磨器及自制工具可以制作各种显微玻璃管针具(工具)。针具制造需要积累经验，不断摸索创造，熟能生巧。 针具做好后竖插于放有海绵泡沫块的培养皿内，并用烧杯罩住。 第二节 几种显微操作技术简介 一、细胞核移植 细胞核移植（nuclear transplantation）就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程而经过无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。 就是将一个细胞核用显微注射的方法放进另一个细胞里去。前者为供体，可以是胚胎的干细胞核，也可以是体细胞的核。受体大多是动物的卵子。因卵子的体积较大，操作容易，而且通过发育，可以把特征表现出来 细胞核移植技术，主要是用来研究胚胎发育过程中，细胞核和细胞质的功能，以及二者间的相互关系；探讨有关遗传，发育和细胞分化等方面的一些基本理论问题。 细胞核移植技术已有几十年的历史。 迄今为止，已有下面9种供核类型的体细胞核移植后代产生：胎儿成纤维细胞 、成体乳腺细胞 、卵丘/颗粒细胞 、输卵管/子宫上皮细胞 、肌肉组织的细胞 、成体耳部成纤维细胞、睾丸支持细胞 、小鼠尾尖细胞 、初乳的乳腺上皮细胞 克隆羊“多莉” 细胞核移植技术流程 ①供体体细胞经细胞培养后，提取细胞核； ②