人类端粒鸟粪-嘌呤四股结构的稳定性摘要.pdfVIP

人類端粒鳥糞-嘌呤四股結構的穩定性 研究者 ：黃昱嘉 梁子誼 指導者：張大釗教授 林玟娟老師 摘要 人類染色體 3’尾端端粒是由 TTAGGG 序列不斷重複所構成，研究發現在鉀離子溶 液中，這段 G-rich 的序列可透過 Hoogsteen 氫鍵形成 G-quartet ，G-quartet 堆疊可形成 G- 四股結構(G-quadruplex, G4) 。 本研究利用三種方法──加入銅離子、加入反譯股 DNA 、升溫──比較G4 穩定劑， 分別為 BMVC 、BRACO-19 、TMPyP4 以及 BMVC-8C 、BMVC-8C3O ，對於會形成不同 G4 結構的人類端粒序列（H23 、H25 、H-NF3 、CTA22 ）之穩定效果。加入銅離子與加入 反譯股 DNA 兩種不同方法所得的結果類似，穩定效果依序為：BRACO-19 、BMVC 、 TMPyP4 ；在升溫實驗中，所得結果各穩定劑較無顯著差異。 由於端粒酶無法作用於形成 G4 結構的 DNA 上，因此 G4 結構的穩定在抗癌上極為 重要。本實驗透過篩選出有潛力的 G4 穩定劑，作為 in vivo 實驗之參考，希望能將其發 展為抗癌藥物。 壹、 研究動機 在去年的科學人雜誌中，我們看到了一篇關於人類端粒的文章，第一次接觸到這個 名詞「端粒」，端粒和癌症及老化有著緊密的關係，我們對此非常感興趣，便上網查了 一些資料，也先後聽了幾場與端粒相關的演講。 2009 年的諾貝爾生理醫學獎得主 E.Blackburn 等人，便是研究端粒以及合成端粒的 端粒酶。人類染色體末端端粒是由 TTAGGG 序列不斷重複組成，染色體的尾端不能完 全複製，所以每經過一次細胞分裂周期，端粒的長度就短少了一些。當端粒序列持續的 短少至某一長度時，細胞會停止分裂，進而導致細胞老化甚至細胞凋亡。生物體藉著端 粒酶機制維持端粒的長度，但是在絕大多數正常細胞中，卻沒有偵測到端粒酶的活性。 文獻報導 85%的癌細胞可藉由活性端粒酶來維持端粒的長度，使其不斷複製。 我們了解到人類染色體末端端粒有著一段長約 5~15kb 的雙股以及 100~200b 的單股 結構，近年來，科學家發現端粒末端的單股 DNA 序列在鈉或鉀離子溶液中會形成鳥糞 嘌呤四股結構(G-quadruplex ,G4) ，這個結構可以影響端粒酶對端粒的作用，如果我們能 控制這個結構的穩定度，便有機會進一步抑制癌細胞的增生，達到治療癌症的效果。由 於 G4 結構可能在人體內扮演很重要的角色，因此瞭解 G4 結構的特性，不管在科學上 或是癌症研究上就具有很大的意義。 貳、 研究目的 人類端粒富含鳥糞嘌呤的單股 DNA 序列可形成許多不同纏繞方式的結構。在鉀離 子溶液中，四個鳥糞嘌呤會圍繞鉀離子形成 G-quartet ( 圖一 a ) ，數個G-quartet 會堆疊 形成 G-四股結構。 G4 大致由其 G strand 的方向及 loop 的位置分類，其種類有 mix-type ( 例如:H23 ，圖 一 b ) ，及anti-parallel ( 例如:H-NF3 ，圖一c ) 。由於G4 結構具有多樣性，因此需要考 量許多變因以設計 G4 穩定小分子。我們想要透過低成本與使用簡單有效率的方法，在 生理條件下量測不同 G4 穩定劑與不同結構 G4 之穩定性的差異，試圖篩選出效果最佳 391 的 G4 穩定劑，並探討影響穩定性的因素。 因此，本研究之目的，探討四股結構穩定劑對不同端粒四股結構的作用及穩定性的 影響。 (a) (b) (c) 圖一 (a)在鉀離子溶液中，四個鳥糞嘌呤會藉由 Hoogsteen 氫鍵形成 G-quartet (b) H23, mix-type ，(c) H-NF3, anti-parallel 。 參、 研究設備及器材 一、實驗儀器 (一) 、