比浊法快速测定硫酸多黏菌素E效价论文.docVIP

　　比浊法快速测定硫酸多黏菌素E效价论文 佟斌 吴兆亮 殷昊 赵艳丽 【摘要】 研究比浊法测定硫酸多黏菌素E效价的影响因素和规律，建立了硫酸多黏菌素E的比浊法快速测定方法，检测时间由杯碟法的20h缩短到4h。当硫酸多黏菌素E的效价为30～100u/ml时，检测菌液接种浓度为5%，培养时间为4h，吸光度对数值与抗生素效价具有良好的线性关系。本法重现性好，相对误差小于5%。 【关键词】 硫酸多黏菌素E 比浊法 效价 Fast determination of the potency of polymyxin E by turbidimetry assay ABSTRACT A turbidimetry assay for fast determination of polymyxin E potency etry assay decreased the determination time from 20 hours to 4 hours. There yxin E and the logarithm of absorbency in the range of 30～100u/ml and inoculating concentration e. The turbidimetry assay had a good reproducibility, and the relative error yxin E; Turbidimetry assay; Potency 多黏菌素E(polymyxin E或colistin)是由多黏芽孢杆菌抗敌素变株(Bacillus polymyxin var.colistinus)经发酵培养生产的一种环状多肽类抗生素，它对革兰阴性杆菌有强烈的抑菌作用［1］。由于多黏菌素E具有高效、低毒、残留少的特性.freelg。 (3)主要仪器 752紫外分光光度计；恒温水浴振荡器；牛津杯(不锈钢，高100mm，外径8.0mm，内径6.0mm)；PHS3C精密pH计。 1.2 方法 (1)检定培养基的制备 称取蛋白胨8g，牛肉膏4g，酵母粉5g，磷酸氢二钾3.3g，磷酸二氢钾1g，氯化钠4.5g，葡萄糖2.5g，加蒸馏水至1000ml加热混匀，调节pH值为7.2，过滤，115℃灭菌30min。 (2)检测菌液的制备 取大肠埃希菌的琼脂斜面培养物一支，加0.9%灭菌生理盐水1ml洗下菌苔转入茄瓶，37℃培养18～22h，用0.9%灭菌生理盐水15ml洗下菌苔，制成菌液，在分光光度计上波长为600nm处用0.9%灭菌生理盐水调节菌液吸光度值(A=2左右)，用此菌液分以2.5%、5%和10%的接种量接种至检定培养基作为检测菌液。 (3)硫酸多黏菌素E标准溶液的配制 精确称取硫酸多黏菌素E标准品，用pH6.0的磷酸盐缓冲液稀释到600u/ml，再用水稀释成浓度分别为30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8种浓度的标准溶液。 (4)比浊法吸光度测定 精密吸取1ml硫酸多黏菌素E溶液，加9ml检测菌液，放入恒温水浴摇床以200r/min转速37℃振荡培养一定时间，取出，立即用冷水冷却，摇匀，以9ml未接种检定培养基和1ml水混合液作参比，用分光光度计在600nm波长处［9］分别测定吸光度。 (5)比浊法样品检测 将样品稀释到适当浓度后，按实验1.2.(4)中有关步骤操作测定吸光度，在吸光度对数效价标准曲线上查对应的效价，乘以稀释倍数，即得到样品的效价。 2 结果与讨论 2.1 检测条件的选择 (1)大肠埃希菌生长曲线的测定 将大肠埃希菌菌液分别以2.5%、5.0%和10%的接种量接入检定培养基，37℃条件下以200r/min振荡培养，在600nm处每小时检测一次培养物的吸光度，结果如Fig.1所示。大肠埃希菌在自然状态下生长时延迟期一般为1h左右，这一时期菌体生长缓慢，菌量基本上维持在最低水平；然后进入指数期，这一时期大约持续7～8h，这一时期菌体生长速率常数最大，生长最迅速；9h以后进入稳定期，菌体总量保持不变。当菌体生长时间在2～4h，吸光度值达到0.4～1.0，处于最佳检测时期。 Innoculating concentration: 1: 2.5%; 2: 5%; 3: 10% Fig.1 Cell grol等8种硫酸多黏菌素E标准溶液各1ml，加9ml接种浓度为5%的检测菌液，放入恒温水浴摇床以转速200r/min 37℃培养4h，取出，立即用冷水冷却，摇匀，以9ml未接种检定培养基和1ml水混合液作参比，用分光光度计在600nm波长处分别测定吸光度，以硫酸多黏菌素E浓度为横坐标，吸光度对数值为纵坐标，绘制标准曲线(Fig.4)。 将吸光度对数值对相应浓