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第五章 细菌检验技术 第一节 细菌形态检验技术 一、细菌染色标本镜检 （一）染色标本检查的基本程序 1、涂片 2、干燥 3、固定 4、染色 染料种类：碱性染料、酸性染料、中性染 料，碱性染料最常用 （1）单染法 用一种染料进行染色，可观察细菌的大小、形态和排列，但不能用于鉴别细菌。如：亚甲蓝染色法 （2）复染法 用两种或两种以上的染料进行染色，不仅可以观察细菌的大小、形态和排列。还可用于鉴别细菌，又称为鉴别染色。 鉴别染色—革兰染色 抗酸染色 复染法的一般步骤 初染－→媒染－→脱色－→复染 5、镜检 显微镜：光学显微镜 所用放大倍数：10×100＝1000 所用镜头：油镜头 镜油：香柏油或石蜡油 香柏油折光率（n＝1.515）与玻片折光率 （n＝1.52）接近 显微镜使用完毕须擦拭镜头。 （二）革兰染色法 1、染液组成： 结晶紫染液、卢戈碘液、95％乙醇、稀释复红 2、染色方法 标本涂片，固定 ?结晶紫初染 （1分钟）→ ?碘液媒染（1分钟） → ?95%乙醇脱色（30秒）→ ?复红复染（3-5分钟） → 3、染色结果 兰阳性菌（G+）——紫色； 革兰阴性菌 (G-) ——红色。 4、染色原理 （1）渗透学说：与肽聚糖结构有关 G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，复红复染后呈红色。 （2）化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关 （3）等电点学说：与细菌所带电荷有关 5、临床意义 鉴别细菌 选择用药 理解细菌的致病作用 6、影响因素 （1）操作因素 ★涂片的厚薄 ★脱色时间的长短 （2）染液因素 ★卢戈碘液放置时间过长 ★ 95％乙醇挥发 ★结晶紫与草酸铵混合时间太长 （3）细菌因素： ★细菌种类、 ★细菌菌龄 （三）抗酸染色法 用于鉴别抗酸杆菌和非抗酸杆菌 步骤：1、苯酚复红加温染色 2、盐酸酒精脱色 3、亚甲蓝复染 结果：抗酸杆菌为红色 非抗酸杆菌为蓝色 （四）其他染色法 1、特殊结构染色法 3、荧光染色 二、细菌不染色标本镜检 应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式 常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映光法 压滴法 悬滴法 3、暗视野聚光法 4、相差显微镜检查法 （二）影响因素 1、操作因素 2、玻片因素 3、光线强度 第二节 细菌接种与培养技术 一、基本条件 （一）接种环与接种针 用于取菌、接种及分离细菌的器具 1、接种针用于挑去单个菌落、穿刺接种及斜面接种 2、接种环用于划线分离培养、纯种接种、挑取菌落和菌液以及制备细菌涂片。 3、接种前后都应对接种环和接种针进行灭菌 （二）红外接种环灭菌器 利用红外线产热进行灭菌 （三）培养皿 制备固体培养基常用的器皿，用于细菌的分离培养。 附：微生物检验常用玻璃仪器的准备 1、玻璃器材的种类及用途 2、玻璃器皿灭菌前的准备 玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的包裹和加塞后才能进行灭菌处理。 3、玻璃器材的清洗 ★新购置的玻璃器材：1％～2％盐酸浸泡－→清水清洗 ★用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷－→清水清洗 细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷 ★盛培养基试管和平皿：高压灭菌－→趁热倒出－→洗涤剂洗刷－→清水冲洗 ★吸管：3％来苏浸泡－→清水冲洗 ★玻片和盖玻片：3％来苏和清洁液浸泡－→清水冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸10min再洗涤 ★含油脂的器皿：单独灭菌 （四）培养箱 1、电热恒温培养箱 2、二氧化碳培养箱 3、厌氧培养箱 （五）培养基 培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。 1、培养基的成分及作用 营养物质：肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐 水 凝固剂：琼脂、明胶 抑制剂 指示剂 2、培养基的种类 （1）按培养基的物理性状分类 液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。 半固体培养基：含0.3％～0.5％琼脂，用于观察细菌的动力。 固体培养基：含2％～2.5％琼脂，多用于细菌的分离培养。 （2）按培养基的用途分类 基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通平板 营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖培