医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌的检测-64.pptVIP

医学微生物学实验综合性实验一 脓汁和粪便标本中病原菌的检测（四） 斜面培养物的观察 显微镜油镜的使用 革兰染色法 肉汤接种法 斜面培养物的观察 分别从斜面的正面和背面观察。 从普通平板上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄色或白色。 从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明（紫黑）或半透明（粉红）。 ※为了讲解方便，以后的实验，仍然沿用初次分离得到的菌落的颜色，紫黑色或粉红色。 从斜面上取菌时，不管是涂片，还是接种，每次只取半个小菌落大小的菌量；接种环或接种针在培养基表面轻轻刮一下即可。 显微镜油镜的使用P13 10×物镜→标本位置→滴加香柏油→100×油镜→浸泡油中,几乎与标本接触（工作距离0.13mm）→细调节调焦，观察物像→记录结果→关闭电源。 油镜处理：擦镜纸拭去香柏油 →擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。 显微镜罩上防尘罩→ 横放在实验柜内。 ★(顺德校区）实验台两侧的电源插座，只能插入一个插头，请选择离你最近的电源插座。 ★（校本部）实验台中间，三个位的插座，中间那位插孔没有电，不能使用，只能用两侧的插座。 细菌的显微镜检查法 显微镜：光学显微镜 目镜：10倍 物镜：油镜头（90或100倍） 放大倍数：10×90或100＝900或1000 镜油：香柏油或石蜡油 香柏油折射率（n＝1.515），玻片折射率（n＝1.52），石蜡油（n＝1.46），空气（n＝1.00）。 ★油镜使用完毕必须擦拭油镜头。 100倍浸油物镜使用方法 油镜放入光路之前，一定要在标本的观察部位上加一滴浸油。 旋转物镜转盘，使油镜进入光路，用微调旋钮对好焦距。 如果浸油内有气泡，会影响观察，可稍微旋转物镜转盘，使油镜来回通过1～2次浸油，排除油内气泡。 革兰染色gram stain 目的要求： 学习并初步掌握革兰染色法。 了解革兰染色法的原理，及其在细菌分类鉴定中的重要性。 革兰染色法是丹麦细菌学家Christain Gram于1884年创立的一种细菌染色方法，已有120多年的历史，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色法。 革兰染色法原理的三种学说 通透性学说：G+菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。G-菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫—碘复合物容易被酒精脱出。 等电学说：G+菌等电点(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般染色时染液的酸碱度在pH7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。 化学学说：G+菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料—媒染剂复合物结合，使已着色的细菌不易脱色。 革兰染色法(gram stain) 涂片 → 干燥 → 固定→ ↓ 结晶紫 → 初染1分钟→水洗→ ↓ 卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→ ↓ 95％乙醇→脱色约20秒钟→水洗→ ↓ 稀释复红→复染1分钟→水洗→ ↓ 吸干,镜检。 ★取菌适量,涂片均匀,水洗轻缓,脱色适当。 ★影响革兰染色的关键步骤是涂片太厚、脱色困难。 细菌的大小与形态 球菌 coccus：直径约1um。不同种类球菌排列方式不同，有不同的名称。如葡萄球菌、链球菌等。 杆菌 bacillus：长短粗细很不一致。中等大小的杆菌直径约1um，长2～3um。 螺形菌 spiral bacteria：菌体弯曲；一个弯曲为弧菌(vibrio)，菌体长2～3um ；数个弯曲为螺菌(spirillum)，菌体长3～6um 。 脓汁标本直接镜检 方法:取标本直接涂片,革兰染色镜检。 初步诊断报告: “查见革兰阳性葡萄串状排列球菌，疑似葡萄球菌”。 “查见革兰阳性链状排列球菌，疑似链球菌。” 细菌在液体培养基的生长情况 均匀浑浊：例如金黄色葡萄球菌, 大肠杆菌。 表面生长形成菌膜：例如枯草杆菌。 沉淀生长：例如链球菌。 安全警告 本次实验操作，可产生几十至几百个微生物气溶胶颗粒。 气溶胶粒径＞100um沉降很快,＜50um在0.4s内扩散开,＜5um通过呼吸道直接到达肺泡。 Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。 实验时应坐着，在酒精灯半径20厘米范围内操作，保持安静、有序