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4.质谱的获得 (1)仪器 带有钠升电喷雾离子源的LTQ-Orbitrap XL的在阳离子模式获得。 （2）设置 电喷雾的电压保持在2.3kv，离子转移温度为200℃没有气流，DDA在MS模式和MS/MS模式自动切换之间获得数据。 离子在注射入轨道离子阱之前，电量必须累积到1000000。在轨道离子阱中，母离子扫描的m/z值范围为300-1800。MS全扫描的强度改变来源于开始时30ms的信号记录。 （3）目标 m/z=400时，寻找60000.MS高分辨率光谱。 （4）结果 5种数量最多的离子（电荷大于1，强度大于15000）被挑选出进行LTQ的MS/MS模式碰撞解离质谱分析。离析宽度为2.5m/z个单元。 选择电荷为3000的离子，碰撞能量设置为35%，激活电量q=0.25，激活时间为30ms，m/z值为母离子值+10ppm，符合条件的用于MS/MS，动态排除45s外的离子。 二）、分子生物学 1.基因获取 利用 PfuX7聚合酶用灯蛾幼虫的cDNA扩增得到以下基因： CYP405A2,CYP332A3,CYP4L17,CYP9A37,CYP405A3,CYP4G47, CYP9A36, CYP6CT1, CYP304F2, CYP6AE27, UGT38A1, UGT35E1, UGT33B1, UGT33A1 and ZfCPR。随后，运用USER技术把这些基因克隆到了USER盒子 2.基因重组 （1）目的 培养一个能够表达ZfCPR的酵母株系和能够产生p450的质粒。我们将ZfCPR的表达组件整合到BY4741酵母株的基因组上。 （2）方法 pLIFE158中ZfCPR的表达盒子在AvrII 和 FseI 位点被限制，不能进入pUC19-MGA质粒，但是，通过使用NB248 和 NB249的PCR技术使ZfCPR的表达盒子不受限制。 通过使用来源于 pLIFE0160的5bp 的SbfI 片段转变BY4741将ZfCPR的表达盒子插入了酵母的基因组。这个线型的片段包含了ZfCPR表达盒子，KANMX 选择基因的两侧是酵母重组序列，使得同源重组成为可能。 良性的转化株被用于G418平板培养，并用表S3列举的NB252, NB253, NB257, NB258寡核苷酸为原料，用PCR技术，转录基因组中正确插入的线性片段。 解除位点限制 插入目的基因 筛选优良 （三）、生物化学方法 1.操作步骤 （1）从200ml的细胞培养液中分离得到酵母微粒体膜。然后根据参考文献38中的方法对其进行诱变。CO差光谱学可以检测表达的p450s的折叠，ZfCPR功能性表达可以通过参考文献39中的细胞色素C还原实验进行检测。 （2）单独测定所有10个异源表达的p450s将2-甲基乙醛肟转化为2-甲基丁醛肟的能力。 仪器操作 ① 将纤维（毛细管柱，85μm碳分子筛，聚二甲基硅氧烷萃取头PDMS StableFlex，57334-U，淡蓝色）置于含水的样品溶液顶部，100μl的样品溶液放置在HPLC的1.5ml小瓶底部。 ②在80℃时搅拌12min后，取出纤维，放入GC/MS系统。毛细管柱是SGE BPX（25QC2/BPX5 0.25)，大气压为50kpa，烘箱温度程序设置如下：50℃恒温2min，5℃/min逐渐升到90℃，90℃恒温1min。注样温度250℃，注样时间为0.5min.每分钟通入15ml氦气。在GC运转期间，那个纤维被留在注样口，这样流动的样品挥发后会被纤维捕获。70ev的电子碰撞质谱仪会记录m/z范围在35-200的离子。 (3)分别测试所有的10个p450s把肟转化成羟腈、丙酮氰酸、2-丁酮氰酸的能力。 羟腈的结构是不稳定的，分解成氰化氢和丙酮或2-丁酮，这些挥发性的酮类被捕获后生成2,4-二硝基苯肼，可以参考文献17中描述的用LG-MS进行分析。 这两种检测P450功能的实验可用0.2mg微粒体蛋白在20mMPH=7.9的缓冲液中，1mMNADPH，10mM氨基酸，0.1mM肟作为基质。 (4)测量这四种异源表达的UGTs将氰醇糖基化产生亚麻苦苷和百脉根苷的能力。 实验用0.2mg微粒体蛋白，在PH=7.9的缓冲液中，10mM糖苷配基，0.02μCi [14C]-UDP-glucose.使用乙烷基：醋酸盐：丙酮：2-氯甲烷：甲醇：水=40:30:12:10:8作为溶剂。 (5)用薄层层析(silica gel type 60 F