口腔微生物分子生物的学2.ppt

第三节 牙发生的分子机制（了解）;;一、釉质形成的分子机制;牙本质开始形成时，介于成牙本质细胞和成秞细胞间的基板开始破裂，一旦牙本质发生矿化，成秞细胞就开始并分泌釉基质。 釉质的发生与成熟可分为 釉质分泌期 釉质成熟期;;;;二、牙本质形成的分子机制;第四节 分子生物学在口腔致病菌研究中的应用;DNA重组技术的应用;一、变形链球菌属致龋毒力因子;（一）葡萄糖基转移酶;;gtf基因具有共同特点 基因长约4000~5000碱基对，编码1500个氨基酸 信号肽（在GTF的氨基端有一段30个氨基酸长的信号肽），使GTF在细胞内合成后分泌至细胞外。 易变段（信号肽之后200~300个氨基酸段） 保守段（1000多个氨基酸组成的长段）;GTF在功能上分为三段： GTF酶催化功能段（信号肽之后的一段氨基酸） 结合底物（蔗糖）、裂解蔗糖并利用其中的葡萄糖基合成葡萄糖。 葡聚糖结合区（羧基端） 该区的肽链可以和葡聚糖结合，有助于变链菌的黏附。（原因：口腔中的游离的变链菌可借助表面的GTF结合至牙菌斑内的变链菌或其他细菌所产生的葡聚糖上。）;A序列的重复 在葡聚糖结合区内，gtf基因的DNA序列呈现多个重复。 在维持完整GTF酶活力上起重要作用。 至少有A序列的三次重复才可能具有结合葡聚糖的能力 至少有A序列的两次重复才能维持GTFI合成能力;;;（二）其他介导变链黏附的因子;果糖基转移酶和果聚糖酶（FTF） 能裂解蔗糖并利用其中的果糖基合成果聚糖。 变链菌表面有果聚酶，在外源性糖缺乏时能裂解牙菌斑中的果聚糖，为细菌的代谢提供营养。可能与致龋有关。 表面蛋白（Ⅰ或Ⅱ或称PAC或SPA） 表面蛋白呈疏水性，有利于细菌与牙面或菌斑之间形成的疏水键结合。 具有黏结素的作用，能特异性的识别牙菌斑中的受体并与之结合，故在变链菌对牙面的早期黏附中起重要作用。 ;（三）变链菌致龋的毒力因子;二、核酸杂交法检测牙周病相关细菌;（二）探针 探针的类型 全基因组探针 克隆DNA片段探针 特定探针 寡核苷酸探针;（三）探针的验证 特异性验证 敏感性验证;（四）核酸杂交的应用及临床意义 加速牙周病致病菌的研究与监测 协助早期诊治及预后判断 根据所查损害区的致病菌情况（种属、数量等）作为判断牙周病是否处于进展期的重要指标。 根据病损区可疑致病菌的抑制或减少情况，监测疗效，便于及时调整治疗方案。;三、基于16SrRNA基因分析的口腔微生物分类与鉴定;（二）原理和方法 核糖体 rRNA 基因存在于所有细胞型生物中，是细胞中最古老的分子之一，在蛋白质合成中起重要作用，具有功能和进化的同源性。 rRNA基因是微生物基因组中最重要而稳定的组成部分，对其序列的分析能够反映微生物的进化关系。 rRNA基因大小适中，在微生物的进化过程中保持相对稳定的生物学功能和保守的碱基排列顺序，同时存在着与进化相一致的突变率，因此出现了进化速率不同的保守区和可变区。可用于亲缘关系较远和较近的物种之间的比较。 广泛存在于原核生物基因组中。;rRNA是目前应用最广泛的分子生物学检测的靶标 含量丰富，检测具有较高的灵敏性 16S rRNA 的编码基因由保守区和可变区组成，保守区为细菌所共有，五明显差别，可变区具有种属特异性。---微生物的分类与鉴定。 该基因的长度为1500bp，基因序列多且长度适宜，适用于克隆和测序。 ;16S rRNA基因扩增与序列分析的主要步骤;（5）结果判断： 当16S rDNA序列同源性﹥99%时，可认为是同一种细菌； 当16S rDNA序列同源性介于97%~99%之间时，可认为是同一属细菌； 当16S rDNA序列同源性﹤97%时，可认为是不同种属的细菌 （6）利用软件程序计算机相关种群的 相似性，并按一定的关系转化成进化距离，通过计算机程序构建系统发育进化树。 ;与传统方法比较;第五节 遗传疾病相关基因的定位、克隆与鉴定;一、遗传学基础知识;;（二）DNA多态性遗传标志 限制性片段长度多态性（RFLP） 小卫星标记 微卫星标记 单核苷酸多态性标记（SNP）;二、疾病相关基因的定位;;三、疾病基因的克隆与鉴定;;四、遗传性乳光牙本质致病基因的定位候选克隆;五、遗传疾病基因克隆的重要意义