第四章 分子克隆技术实验操作手册.pdfVIP

生物秀实验频道——生命科学实验中心 /bio101 子克隆技术 子克隆技术 子克隆技术 实验操作手册2005 生命科学技术学院 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 /bbs 生物秀实验频道——生命科学实验中心 /bio101 课程简介 分子克隆技术是指DNA 的无性繁殖技术。 子克隆技术课程主要是针对生物技术 专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实 验课。实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆和 子杂交两大部分： 分子克隆技术：DNA 重组技术是分子生物学的核心内容。本实验利用质粒载体克 隆外源DNA 片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA 的准备、 酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。 分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有 Southern blotting ，Northern blotting ，Western blotting 及Dot blotting 等。Southern blotting 是通过用一种或多种限制 性内切酶消化基因组或其它来源的 DNA ，经过琼脂糖凝胶电泳按大小 离酶切所得的 片段，随后DNA 在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（硝酸纤维素膜或尼 龙膜）。DNA 转移至固相支持物的过程中各DNA 的相对位置保持不变，用一定方法(如 放射性同位素)标记的DNA 探针与固着在膜上的DNA 杂交，经X-光片自显影显现出与 探针DNA 互补的DNA 电泳条带的位置，然后进行 析。本实验要求掌握植物总DNA 的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA 的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、 同位素操作等方 的实验技术。在转录水平上研究和了解基因的表达与调控是分子生物 学和基因操作的重要内容。为让学生初步了解有关RNA 的操作过程注意事项，我们还 列出Northern blotting 的操作步骤以供选择。 1 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 /bbs 生物秀实验频道——生命科学实验中心 /bio101 目 录 系列一 分子克隆技术4 实验一 质粒的制备4 实验二 DNA 的琼脂糖凝胶电泳5 实验三 外源DNA 片段在质粒载体中的克隆6 实验四 感受态细胞的制备9 CaCl2 感受态细胞的制备实验步骤9 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤 10 实验五 质粒的转化及转化子的鉴定 11 热激法转化实验步骤： 11 质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤 12 实验六 PCR 技术 12 系列二 Southern 杂交技术 14 实验一 植物总DNA 的快速少量抽提 （CTAB 法） 14 实验二 总DNA 质量检测及酶切 15 实验三 电泳、转膜 16 实验四 Southern Blotting 18 系列三 Northern Blotting 24 实验一 RNA Extraction (mini prep) 24 实验二 RT-PCR (Reverse transcription PCR)26 实验三 RNA 的电泳，转膜和杂交28 附录 试剂配方29 一 菌培养